一、背景

小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株是一種用于實(shí)驗(yàn)研究的細(xì)胞系，來源于小鼠的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。這些細(xì)胞通常被用于研究腦微血管的功能和疾病，以及進(jìn)行藥物篩選和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等。

小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株的獲取和培養(yǎng)需要一定的技術(shù)和設(shè)備支持，建議在專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室或科研機(jī)構(gòu)進(jìn)行。同時(shí)，由于這些細(xì)胞系具有一定的特殊性和差異性，其使用和實(shí)驗(yàn)結(jié)果也需要根據(jù)具體情況進(jìn)行評估和分析。

鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株是一種來源于小鼠腦部微血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞系。這些細(xì)胞通常在體外培養(yǎng)條件下生長和繁殖，并可以用于研究腦血管疾病的發(fā)生機(jī)制、藥物篩選和治療等。

二、小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株具有以下特點(diǎn)

形態(tài)特征：小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株呈多邊形或長方形，大小不一，通常有較多的突起和偽足。

生長特性：小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株生長迅速，可以在體外培養(yǎng)條件下持續(xù)傳代。

耐藥性：小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株對多種化療藥物具有耐藥性，這使得它成為研究腦血管疾病耐藥性的重要工具。

應(yīng)用前景：小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株在腦血管疾病的診斷、治療和預(yù)防方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

三、小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。

下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

四、應(yīng)用

小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株可以用于小鼠神經(jīng)細(xì)胞中CBS催化生成的H2S對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和形成血管的影響及與VEGFR2的關(guān)系：

在體外觀察了神經(jīng)元CBS催化產(chǎn)生的H2S對小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株的增殖、遷移和形成血管的影響,并初步探討了其作用與VEGFR2的關(guān)系。

目的：

1、觀察H2S對小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株增殖遷移的作用。

2、探討VEGFR2與H2S促進(jìn)小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株增殖遷移作用的關(guān)系。

3、探討細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度與H2S促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移作用的關(guān)系。

4、觀察H2S對內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的影響。

方法：

1、進(jìn)行三種細(xì)胞株的傳代培養(yǎng),利用Transwell系統(tǒng)將小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞(HT22細(xì)胞)與小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株(b End.3細(xì)胞)進(jìn)行共培養(yǎng)。

2、采用siRNA小干擾技術(shù),建立細(xì)胞轉(zhuǎn)染模型。

3、CCK-8法檢測小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株的增殖。

4、細(xì)胞劃痕法和Transwell法檢測小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株的遷移。

5、甲基藍(lán)法檢測共培養(yǎng)體系內(nèi)H2S的含量。

6、鈣熒光成像法檢測小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株胞內(nèi)游離Ca2+濃度。7.血管生成實(shí)驗(yàn)檢測H2S對內(nèi)皮細(xì)胞成管能力的影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與溶媒對照組比較,加入H2S供體Na HS(1×10-8～1×10-3.5 M)培養(yǎng)24 h時(shí),小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株b End.3細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC細(xì)胞增殖有明顯的增強(qiáng)(P<0.01)。VEGF164(10 ng/m L)有類似的增強(qiáng)作用(P<0.01)。結(jié)果表明外源性H2S對小鼠腦微血管和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖有明顯的促進(jìn)作用。與溶媒對照組相比,加入1×10-3.5 M Na HS 1 h時(shí),b End.3細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞的增殖作用不明顯,但在6 h時(shí)的增殖作用開始增強(qiáng)(P<0.01),并且在48 h時(shí),Na HS增殖作用進(jìn)一步增加(P<0.01)。在b End.3細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞中分別加入VEGFR2阻斷劑SU5416 10μM培養(yǎng)24 h對這兩種細(xì)胞的增殖均無明顯的影響,但可顯著地抑制1×10-3.5 M Na HS引起的b End.3細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞的增殖(P<0.01),提示外源性H2S促進(jìn)小鼠腦微血管和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用可能與VEGFR2有關(guān)。

2、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中,與溶媒對照組相比,Na HS(1×10-6～1×10-3.5 M)加入24 h可明顯并呈濃度依賴性地增加小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株b End.3細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞的遷移面積(P<0.01);Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與溶媒對照組相比,加入Na HS 1×10-3.5 M 24 h可明顯地增加b End.3細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞從Transwell上室膜內(nèi)遷移到膜外的細(xì)胞數(shù)(P<0.01)。10 ng/m L VEGF164對小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株b End.3細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞的遷移面積和遷移細(xì)胞數(shù)有類似的作用(P<0.01)。結(jié)果表明外源性H2S可明顯地促進(jìn)小鼠腦微血管及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。SU5416單獨(dú)加入24 h對b End.3細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)無明顯的影響,但可顯著地減少1×10-3.5 M Na HS或10 ng/m L VEGF164引起的b End.3細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)的增加(P<0.01),提示外源性H2S促進(jìn)小鼠腦微血管及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移可能與VEGFR2有關(guān)。

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