【原理】

  間接紅細(xì)胞凝集（簡稱間接血凝）試驗是以紅細(xì)胞為抗原或抗體的載體，根據(jù)抗原和抗體的特異性反應(yīng)，用已知抗原測定未知抗體或用已知抗體測定未知抗原的一種微量、快速、敏感的血清學(xué)方法。

  根據(jù)致敏用抗原或抗體的不同和參加反應(yīng)成分的不同，間接血凝可分為以下3種。

  （一）間接血凝試驗

  將細(xì)菌多糖質(zhì)或各種蛋白質(zhì)抗原吸附在紅細(xì)胞表面上，該紅細(xì)胞稱為抗原致敏紅細(xì)胞，這種抗原致敏的紅細(xì)胞就具備了一種新的血清學(xué)性質(zhì)，當(dāng)與相應(yīng)的抗血清相遇時，在適宜條件下，抗原就和抗體結(jié)合起來，因此紅細(xì)胞也被動地凝集起來。

  （二）反向間接血凝試驗

  將抗體致敏在紅細(xì)胞上，以測定相應(yīng)的抗原。

  （三）間接血凝抑制試驗

  這一方法多是利用抗原致敏的紅細(xì)胞來測定可溶性抗原。其基本原理是將待測的可溶性抗原液中加入已知的抗體，待反應(yīng)后，再加入抗原致敏的紅細(xì)胞，由于加入的抗體和待測抗原已先行結(jié)合，所以抗原致敏紅細(xì)胞的凝集被抑制。

【成分】

【制法】

  1.醛化紅細(xì)胞：

  (1）紅細(xì)胞：多種動物的紅細(xì)胞均可用于間接血凝試驗。一般多用綿羊和人“O”型紅細(xì)胞。我們認(rèn)為綿羊紅細(xì)胞在多方面是滿意的，例如綿羊紅細(xì)胞容易大量獲得，不同批次致敏的紅細(xì)胞，波動范圍較小，血凝模式也比較穩(wěn)定。

  (2）脫纖維血的制備：目前多用阿氏保存液來抗凝和保存紅細(xì)胞，方法是以無菌手續(xù)采集綿羊血或其他動物血液，按1:3（全血：保存液）的比例置于保存液中，立即充分搖動5~8分鐘，以防止發(fā)生凝塊，保存在4℃冰箱備用。

  (3）沉積紅細(xì)胞體積的測量：

   ①取薄層脫脂棉鋪于玻璃漏斗中。

   ②將保存液中的血液，通過上述漏斗，過濾在其他容器中以除去可能凝結(jié)的clot，記下濾液的總量。

   ③將過濾的血液混均，取10ml置于刻度離心管中，3000rpm30分鐘，輕輕取出離心管，沉積的紅細(xì)胞呈水平液面（水平轉(zhuǎn)頭離心），讀取紅細(xì)胞高度，從總量算出壓積紅細(xì)胞的總體積。

  (4）醛化紅細(xì)胞：新鮮紅細(xì)胞經(jīng)醛類固定以后，可大大延長可用期。常用的醛類有甲醛、戊二醛及丙酮醛。不同醛類固定的紅細(xì)胞經(jīng)致敏后，血凝反應(yīng)的敏感性是不同的。雙醛化的紅細(xì)胞可提高血凝反應(yīng)的敏感性。現(xiàn)僅例舉戊二醛固定法。

  戊二醛固定法：

   ①將綿羊或人“O”型紅細(xì)胞用0.15molpH7.2磷酸鹽緩沖液洗5次。

   ②把洗過的細(xì)胞和1％戊二醛溶液預(yù)先放在冰浴中，使冷卻到6~8℃。

   ③按沉積紅細(xì)胞10ml加入1％戊二醛溶液100ml計算，在冰浴中將1％戊二醛溶液加到洗過的紅細(xì)胞中，邊加邊搖，在冰浴中醛化45分鐘。

   ④將醛化的紅細(xì)胞用生理鹽水洗5次，然后配成10％醛化紅細(xì)胞，放普通冰箱備用。

  (5）醛化紅細(xì)胞的性質(zhì)：

   ①醛化后的紅細(xì)胞，鏡檢一般呈兩面凸起的圓盤狀，有的呈輕度變形。大部呈散在狀態(tài)，也有的數(shù)個細(xì)胞堆在一起。

   ②醛化的紅細(xì)胞總體積有不同程度的增加，一般約増加10%~20%，體積增加的程度取決于醛化過程中紅細(xì)胞的破壞程度和洗滌時損失的多少而定。疊氮鈉可使醛化的紅細(xì)胞顏色變紅。

   ③醛化紅細(xì)胞抵抗低滲溶解和機(jī)械振蕩的能力甚強(qiáng)，反復(fù)凍融和在蒸餾水中皆不溶血，加溫60℃亦不被破環(huán)。凍干后重新懸浮，無明顯變化。

   ④醛化的紅細(xì)胞，不妨礙紅細(xì)胞表面化學(xué)基團(tuán)對抗原或抗體的吸附。

  2.致敏方法：自Boyden (1951）用鞣酸處理紅細(xì)胞將蛋白質(zhì)抗原致敏在紅細(xì)胞上以后，又研究出來多種新的致敏方法，這些方法各有其特點。今將我們常用的鉻-鞣酸法介紹如下。

  鉻-鞣酸法致敏紅細(xì)胞：

  (1)取10％醛化紅細(xì)胞0.3ml置于刻度離心管中，用4ml生理鹽水洗兩次，去上清；

  (2)加2ml用0.075molpH5.0醋酸緩沖液稀釋的抗體（0.05~1mg/ml)，混均，再加用生理鹽水稀釋的三氯化鉻（10~20μg/ml)2ml，混均，再加生理鹽水稀釋的1:20000鞣酸2ml，混均；

  (3)于37℃水浴中致敏10分鐘，此期間混均兩次；

  (4)離心去上清，用1%NRS洗兩次；

  (5)*后加4ml1%NRS,配成0.75％致敏紅細(xì)胞備用。

【用途】

  間接血凝技術(shù)，由于具有快速、敏感和簡便的優(yōu)點，已成為廣泛應(yīng)用的血清學(xué)方法之一，它不但是研究傳染病、寄生蟲病的病原學(xué)、免疫學(xué)和流行病學(xué)的良好手段，而且亦用于血液病病因、自家免疫病、過敏性疾病以及生長激素的研究。

【注意事項】

  1．致敏用蛋白質(zhì)抗原或抗體的純度對血凝效果的好壞至關(guān)重要。如果抗原或抗體不純，雜蛋白可明顯地影響致敏效果，純度高、蛋白量少、效價高的抗體可獲得血凝效價高和穩(wěn)定性好的抗體血球。

  2．致敏用抗原或抗體的理化性質(zhì)。蛋白質(zhì)抗原和抗體由于其本身固有的性質(zhì)不同，致敏紅細(xì)胞的效果也不同，有的經(jīng)純化后不經(jīng)任何處理，即可獲得良好的致敏效果，而另外一些蛋日質(zhì)抗原和抗體需使之發(fā)生輕度變性，才具有較好的致敏效果。

  3．用鞣酸方法致敏時，鞣酸濃度須合適，一般常用的濃度對1:20000。紅細(xì)胞經(jīng)鞣酸處理后變?yōu)椴环€(wěn)定，而用1％正常兔血清鹽水來穩(wěn)定鞣化的紅細(xì)胞，可得到較好效果。

  4．致敏的抗原或抗體濃度與血凝反應(yīng)的敏感性和特異性明顯關(guān)系。合適量的致敏用抗原或抗體需先滴定。