最初，從患者供體中分離出 PBMC。由于 CAR-T 細(xì)胞的最終產(chǎn)量可能會受到起始原材料的影響，因此通過流式細(xì)胞術(shù)檢測記憶 T 細(xì)胞、活化 T 細(xì)胞和耗竭 T 細(xì)胞的比例，為免疫細(xì)胞群體的異質(zhì)性設(shè)定了一個基準(zhǔn)，并且如果在工程化之前分離 T 細(xì)胞，還可以確定樣本的總體純度（圖 1，Stage 1）。

圖 2 展示了免疫細(xì)胞治療過程（圖 1）的 Stage 1 (Day 0)，供體 PBMCs 中表達記憶標(biāo)志物（CD45RO/CD45RA）、激活標(biāo)志物（CD69/CD38）和耗竭標(biāo)志物（TIM-3/LAG-3）的 T 細(xì)胞亞群分型。

圖 2  采用流式細(xì)胞術(shù)的多色 T 細(xì)胞檢測 Panel 對 PBMC 細(xì)胞進行 T 細(xì)胞記憶、激活和耗盡的表征。冷凍保存的人（第 0 天）PBMCs 復(fù)蘇后，用三種流式細(xì)胞術(shù)檢測 panel 進行染色，以評估其在 T 細(xì)胞激活之前的初始（na?ve）、記憶、耗竭和激活表型。PBMCs 首先用 anti-human CD3 mFluor™ Violet 450、CD4 mFluor™ Violet 500、CD8 Alexa Fluor^® 700 以及 Live/Dead 750/777 viability dye 進行染色，隨后用三種不同的檢測 Panel 分別評估 T 細(xì)胞的 1）記憶（CD45RO Alexa Fluor^® 647、CD45RA mFluor™ Violet 610 和 CCR7 PE），2）耗竭（PD-1 Alexa Fluor^® 647、TIM-3 PE 和 LAG-3 mFluor™ Violet 610），以及 3）激活（CD25 mFluor™ Violet 610、CD69 PE 和 CD38 Alexa Fluor^® 647）。

在 T 細(xì)胞激活和細(xì)胞培養(yǎng)擴增過程中（圖 1，Stage 2），通過流式細(xì)胞術(shù)進行免疫表型分析，用于評估 T 細(xì)胞激活的變化以及 T 細(xì)胞亞群分布的總體變化。這些變化對于理解 T 細(xì)胞工程的成功與否以及最終產(chǎn)品的產(chǎn)量至關(guān)重要。

圖 3 展示了免疫細(xì)胞治療過程（圖 1）Stage 2：擴增 T 細(xì)胞的第 2 天激活表型以及第 9 天的記憶和耗竭表型鑒定。

圖 3  采用流式細(xì)胞術(shù)的多色 T 細(xì)胞檢測 Panel 對激活的 T 細(xì)胞進行 T 細(xì)胞記憶、激活和耗盡的表征。人外周血單個核細(xì)胞（PBMCs）用生物素標(biāo)記的 GMP Anti-Human CD3（貨號 MAB11411-GMP）和 GMP Anti-Human CD28（貨號  MAB11412-GMP）與 M-270 磁珠偶聯(lián)，并加入 200 IU/mL 的 GMP Recombinant Human IL-2（貨號 BT-202-GMP）刺激 9 天。第 9 天擴增的 T 細(xì)胞 anti-human CD3 mFluor™ Violet 450、CD4 mFluor™ Violet 500、CD8 Alexa Fluor^® 700 以及 Live/Dead 750/777 viability dye 進行染色，隨后用三種不同的檢測 Panel 分別評估 T 細(xì)胞的 1）記憶（CD45RO Alexa Fluor^® 647、CD45RA mFluor™ Violet 610 和 CCR7 PE），2）耗竭（PD-1 Alexa Fluor^® 647、TIM-3 PE 和 LAG-3 mFluor™ Violet 610），以及 3）激活（CD25 mFluor™ Violet 610、CD69 PE 和 CD38 Alexa Fluor^® 647）。

流式細(xì)胞術(shù)可檢測供體 T 細(xì)胞之間的記憶、激活和耗竭標(biāo)志物的差異。圖 4 展示了從第 0 天到第 2 天（用于激活）或第 9 天（用于記憶和耗竭）使用流式細(xì)胞術(shù)檢測 Panel，可以提供關(guān)于供體 T 細(xì)胞隨時間變化的定量數(shù)據(jù)。

圖 4 T 細(xì)胞記憶、激活和耗竭檢測 Panel 追蹤檢測 T 細(xì)胞群隨時間的變化。人 PBMCs 被用生物素標(biāo)記的 GMP Anti-Human CD3 (貨號 MAB11411-GMP) 和 GMP Anti-Human CD28 (貨號  MAB11412-GMP) 與 M-270 Dynabeads + 200 IU/mL GMP Recombinant Human IL-2 (貨號 BT-202-GMP) 刺激 9 天，如圖 4。在激活后，分析了 Day 0（Stage1）和 Day 9（A、B）以及 Day 2（C）的 CD45RO+/CCR7+中央記憶 T 細(xì)胞（A）、PD-1+細(xì)胞（B）和 CD25+/CD69+細(xì)胞（C）的表達差異。