骨重塑：指的是破骨細(xì)胞清除舊骨或受損骨質(zhì)，并由成骨細(xì)胞形成的新骨取代的過(guò)程。

骨骼，是一種動(dòng)態(tài)組織。其在人的整個(gè)生命過(guò)程中是不斷被重塑的。持續(xù)重塑是維持骨骼關(guān)鍵功能所必需的，它能防止骨損傷的積累，并維持骨骼的機(jī)械強(qiáng)度和鈣穩(wěn)態(tài)^[1]。

骨重塑過(guò)程由破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的“交流”來(lái)調(diào)控完成^[2]。

• 破骨細(xì)胞 (osteoclasts，OCs)：是一種骨吸收細(xì)胞，源自造血干細(xì)胞，它通過(guò)分泌酸性酶和蛋白水解酶來(lái)降解骨質(zhì)。

• 成骨細(xì)胞 (Osteoblasts，OBs)：是一種骨形成細(xì)胞，它由間充質(zhì)前體細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄因子的連續(xù)作用下分化為骨祖細(xì)胞譜系而產(chǎn)生，并最終分化為骨細(xì)胞。

圖 1. 破骨細(xì)胞生成和成骨細(xì)胞生成的策略^[1]。

骨礦化：指的就是鈣的沉淀過(guò)程。鈣、磷等無(wú)機(jī)鹽沉淀在骨頭組織的過(guò)程，就叫骨的礦化。

簡(jiǎn)單說(shuō)，礦化是進(jìn)化過(guò)程中的一種被動(dòng)選擇。

生物礦化的起源可以追溯到前寒武紀(jì)晚期，當(dāng)時(shí)構(gòu)造活動(dòng)導(dǎo)致海水中可溶性礦物顯著增加。人們普遍認(rèn)為，海洋生物首先發(fā)展出由碳酸鈣和/或磷酸鈣礦物組成的原始外骨骼，漸漸地，骨骼組織被內(nèi)化。礦化骨骼強(qiáng)大的承重能力使得大型脊椎動(dòng)物得以進(jìn)化^[3]。

作為一種特殊的結(jié)締組織，骨骼具有高度礦化的結(jié)構(gòu)和構(gòu)造。一方面，作為內(nèi)部支撐系統(tǒng)，骨骼可為身體提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，并為運(yùn)動(dòng)提供肌肉附著點(diǎn)。同時(shí)，骨骼還保護(hù)大腦和內(nèi)臟器官，并為骨髓造血組織提供場(chǎng)所。此外，骨骼也是無(wú)機(jī)離子 (尤其是磷酸鹽和鈣) 的主要來(lái)源和儲(chǔ)存地，它們能夠積極參與體內(nèi)礦物質(zhì)穩(wěn)態(tài)和能量代謝^[4]。

骨吸收：指的是骨鈣溶出的過(guò)程。也就是把鈣從骨頭里面“搬”出來(lái)。破骨細(xì)胞將硬骨組織分解為礦物質(zhì)，同時(shí)將骨骼中的鈣釋放至血液中。

破骨細(xì)胞是僅有的明確可降解骨的細(xì)胞，在骨穩(wěn)態(tài)和健康維持中至關(guān)重要。

破骨細(xì)胞是一種組織特異性的多核巨噬細(xì)胞，由血液及骨髓中的單核/巨噬細(xì)胞系分化而來(lái) (圖 2)。其分化過(guò)程經(jīng)歷破骨細(xì)胞前體 (osteoclast precursor cells，OPCs，或稱 preosteoclasts)、融合的多核破骨細(xì)胞 (non-functional polykaryons)、成熟破骨細(xì)胞 (mature osteoclasts，也稱極化的多核破骨細(xì)胞) 等幾個(gè)階段。

               

如圖 2 所示，M-CSF（CSF-1）和 RANKL 對(duì)破骨細(xì)胞生成至關(guān)重要，二者缺一不可。OPG 可以結(jié)合并中和 RANKL，從而負(fù)向調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞生成和成熟破骨細(xì)胞的活化。

目前，已有大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)破骨細(xì)胞形成和功能失調(diào)與骨質(zhì)疏松癥、骨折愈合、骨關(guān)節(jié)炎和原發(fā)性/轉(zhuǎn)移性骨腫瘤等密切相關(guān)^[2]。體外誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化對(duì)研究骨代謝疾病、藥物篩選具有重要作用。

實(shí)驗(yàn)方案

2. BMMs 貼壁篩選

(1) 用 5 mL 含 10% FBS  的 α-MEM 培養(yǎng)基重懸，離心，棄上清。

(2) 用 5 mL 含 M-CSF (25 ng/mL) 和 10% FBS 的 α-MEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。接種于 6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中 (每只小鼠一孔)，置于 37°C、5% CO₂ 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。

(3) 收集上清離心，棄上清液 (主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞)，用 5 mL 含有 50 ng/mL M-CSF 的培養(yǎng)基重懸后，以 5×10⁴ cells/孔的密度接種于 24 孔板中 (每孔 1 mL)，2-3 天后貼壁細(xì)胞即為骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞；

3. 破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化

(1) 棄上清液，用無(wú)菌 PBS 清洗 2 次。使用含有 50 ng/mL M-CSF 和 50 ng/mL RANKL 的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化；

(2) 細(xì)胞每 3 天換一次液，并補(bǔ)加因子 25 ng/mL M-CSF 和 50 ng/mL RANKL，4-6 天后進(jìn)行誘導(dǎo)鑒定。

MCE 客戶驗(yàn)證

實(shí)驗(yàn)方案

MCE 客戶驗(yàn)證

1. 多核巨細(xì)胞

破骨細(xì)胞產(chǎn)生許多酶，其中主要是抗酒石酸酸性磷酸酶 (tartrate-resistant acidic phosphatase, Trap)，Trap 特異地分布于破骨細(xì)胞中，通常作為鑒別破骨細(xì)胞的重要標(biāo)志物。

【實(shí)操步驟】

• 細(xì)胞樣本 (以 48 孔板為例)：

(1) 移除細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入 400 μL PBS 清洗，棄液。

(2) 每孔加入 300 μL 4% 多聚甲醛溶液，室溫固定 15-30 min，棄液。

(3) 每孔加入 300 μL PBS，清洗 2 次。

(4) 染色：每孔加入 150-200 μL TRAP 染色液，37℃ 避光孵育 10-15 min (待測(cè)樣品中酒石酸酸性磷酸酶活性較低時(shí)，可適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間至 30 分鐘或顯微鏡下顯色至預(yù)期深淺)。

(5) 每孔加入 300 μL PBS，清洗 2 次。

(6) 顯微鏡下觀察和拍照。

2. 骨吸收實(shí)驗(yàn)

(1) RAW264.7 細(xì)胞在含有 10% FBS 的 RPMI-1640 或 DEME 培養(yǎng)基中可以增殖并保持其分化為破骨細(xì)胞的能力，而其在含有 10% FBS 的 α-MEM 中培養(yǎng)可進(jìn)行破骨細(xì)胞分化試驗(yàn)。

(2) RAW264.7 分化為破骨細(xì)胞的成功與否與細(xì)胞狀態(tài)密切相關(guān)，建議使用 15 代以內(nèi)的 RAW264.7 細(xì)胞。

(3) 分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基工作液建議現(xiàn)配現(xiàn)用，使用前注意 37 ℃ 溫育。

(4) 使用的 RANKL 和 M-CSF 濃度可能因小鼠和實(shí)驗(yàn)室條件而異。

(5) 破骨細(xì)胞形成初期，細(xì)胞呈紡錘形，成熟后，細(xì)胞變大，多核，呈圓形。從 RANKL 和 M-CSF 添加后的第 4 天起，每天至少觀察一次細(xì)胞，因?yàn)樾∈笃乒羌?xì)胞在分化后非常不穩(wěn)定。

(6) 誘導(dǎo)成功后立即進(jìn)行染色，小鼠破骨細(xì)胞在成熟后 24 h 內(nèi)死亡。

產(chǎn)品推薦

RANKL/TNFSF11 Protein, Mouse (HY-P7425) RANKL 是 RANK 的激活劑。當(dāng)與 RANK 結(jié)合后，其誘導(dǎo)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞譜系細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞，并進(jìn)一步導(dǎo)致破骨細(xì)胞前體成熟。

M-CSF Protein, Mouse (HY-P7085) M-CSF 是調(diào)節(jié)造血前體細(xì)胞（特別是單核吞噬細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞）存活、增殖和分化的關(guān)鍵協(xié)調(diào)因子。

TNFRSF11B/OPG Protein, Mouse (HEK293, His) (HY-P71017) 競(jìng)爭(zhēng)性抑制 RANKL-RANK 結(jié)合，負(fù)調(diào)控破骨細(xì)胞生成。

Red Blood Cell Lysis Buffer (HY-3010) 即用型溶液，能快速、有效的從人或鼠等的血液或組織樣品中裂解并去除無(wú)核紅細(xì)胞，不影響白細(xì)胞、正常組織或腫瘤細(xì)胞。

DMEM (High Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, no HEPES) (HY-K3001) 廣泛使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

Rhodamine Phalloidin (HY-K0903) 羅丹明偶聯(lián)的 Phalloidin，檢測(cè)細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)的形成。

TRAP Antibody (YA2321) (HY-P82576) 適用于 Human, Mouse, Rat 的 WB, IHC-P, ICC/IF, IP。

NFAT2 Antibody (HY-P80243) 適用于 Human 的 WB, IHC-P, FC。

 

[1] Kim JM, et al. Osteoblast-Osteoclast Communication and Bone Homeostasis. Cells. 2020 Sep 10;9(9):2073. 

[2] DONG Shiwu, et al. Break and then stand: novel insight into osteoclast functions in the skeletal system[J]. Journal of Army Medical University, 2022, 44(1): 79-88. 

[3] Murshed M. Mechanism of Bone Mineralization. Cold Spring Harb Perspect Med. 2018 Dec 3;8(12):a031229. Erratum in: Cold Spring Harb Perspect Med. 2020 Aug 3;10(8):a040667. 

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[6] Toda G, et al. Preparation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice for functional analysis. STAR Protoc. 2020 Dec 31;2(1):100246. 

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