一、細胞特性與應(yīng)用價值

永生化小鼠牙根尖乳頭祖細胞（Immortalized Mouse Dental Apical Papilla Progenitor Cells，簡稱 iSCAP）是一種具有自我更新和多向分化潛能的細胞系，它來源于小鼠牙根尖乳頭組織。這些細胞在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下，可以分化為成牙本質(zhì)細胞、成牙骨質(zhì)細胞、成纖維細胞等多種細胞類型，這使得它們成為牙髓再生、牙周組織工程以及顱頜面組織修復(fù)等研究領(lǐng)域的重要工具。

在牙髓再生研究中，iSCAP 細胞能夠模擬牙髓組織的生理環(huán)境，幫助研究人員深入了解牙髓細胞的分化機制和再生過程。通過實驗操作，可以探索如何利用這些細胞來修復(fù)因齲齒、外傷等原因?qū)е碌难浪钃p傷，從而為臨床牙髓再生治療提供理論依據(jù)和實驗?zāi)Ｐ?。此外，iSCAP 細胞還可以用于研究牙齒發(fā)育過程中的細胞分化路徑以及相關(guān)信號通路的調(diào)控機制，這對于揭示牙齒發(fā)育異常的病因和尋找治療方法具有重要意義。同時，它們也為藥物篩選和毒性測試提供了一個體外模型，可以快速評估藥物對牙髓組織細胞的影響，加速口腔藥物的研發(fā)進程。

二、細胞培養(yǎng)前的準備工作

（一）培養(yǎng)設(shè)備與器材檢查

在進行細胞培養(yǎng)之前，對培養(yǎng)設(shè)備和器材進行全面檢查是確保實驗順利進行的關(guān)鍵步驟。首先檢查細胞培養(yǎng)箱，確認其溫度、濕度和 CO? 濃度的控制系統(tǒng)是否正常。一般來說，細胞培養(yǎng)箱的溫度應(yīng)精準維持在 37℃，濕度需保持在 95% 左右，而 CO? 濃度則應(yīng)穩(wěn)定在 5%。這三個參數(shù)對于模擬細胞在體內(nèi)的生長環(huán)境至關(guān)重要。如果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)箱的任何參數(shù)出現(xiàn)偏差，應(yīng)立即進行校準或維修，以確保細胞能夠在適宜的環(huán)境中生長。

顯微鏡是觀察細胞形態(tài)和生長狀態(tài)的工具。檢查顯微鏡的目鏡和物鏡是否清潔無污，調(diào)節(jié)焦距的裝置是否靈活有效。只有通過清潔且功能正常的顯微鏡，才能清晰準確地觀察到細胞的細微結(jié)構(gòu)，如細胞核的形狀、細胞質(zhì)的分布以及細胞間的連接情況等，從而及時發(fā)現(xiàn)細胞生長過程中的異常變化。此外，還需檢查培養(yǎng)皿、離心管等耗材的質(zhì)量。確保培養(yǎng)皿表面平整光滑、無劃痕、無裂紋，離心管密封性能良好、無破損。使用前，對所有耗材進行高壓滅菌處理（121℃，15 - 20 分鐘）或直接使用無菌包裝的一次性耗材，以防止細菌、真菌等微生物污染細胞，影響實驗結(jié)果。

（二）培養(yǎng)基配制與滅菌

配制適合 iSCAP 細胞生長的培養(yǎng)基是細胞培養(yǎng)成功的另一個關(guān)鍵因素?；A(chǔ)培養(yǎng)基通常選擇 α - Minimum Essential Medium（α - MEM）或 Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM），這些培養(yǎng)基含有細胞生長所需的基本營養(yǎng)成分，如碳水化合物、氨基酸和維生素等。除了基礎(chǔ)培養(yǎng)基外，還需添加 10% - 15% 的胎牛血清（FBS），胎牛血清富含多種細胞生長因子、激素和黏附因子，能夠為細胞提供豐富的營養(yǎng)支持，促進細胞的生長和增殖。同時，加入青霉素 - 鏈霉素溶液（100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 鏈霉素）以防止細菌和真菌的污染。根據(jù)不同實驗的具體需求，還可以添加其他成分，如表皮生長因子（EGF）、成纖維細胞生長因子 - 2（FGF - 2）等，以優(yōu)化細胞的生長環(huán)境，滿足細胞在不同生長階段的營養(yǎng)需求。

配制好的培養(yǎng)基需要進行高壓蒸汽滅菌處理。將培養(yǎng)基分裝到合適的容器中，設(shè)置壓力為 100 - 105 kPa，溫度為 121℃，滅菌 15 - 20 分鐘。在滅菌過程中，要確保培養(yǎng)基不過度沸騰，以免造成成分的丟失或變性。滅菌完成后，將培養(yǎng)基調(diào)至 4℃保存，待使用前再恢復(fù)至室溫，以保持培養(yǎng)基中各種成分的穩(wěn)定性和活性。

三、細胞復(fù)蘇的規(guī)范操作

從凍存狀態(tài)復(fù)蘇 iSCAP 細胞是細胞培養(yǎng)的起始步驟，正確的操作可以確保細胞的活性和正常生長。首先，準備一個 37℃左右的水浴鍋，將含有凍存細胞的凍存管從液氮罐中迅速取出，立即放入水浴鍋中，并用鑷子快速搖動凍存管，使細胞在 1 - 2 分鐘內(nèi)全融化?？焖偃诨梢宰畲笙薅鹊販p少細胞在低溫到常溫過程中受到的損傷，提高細胞的復(fù)蘇率。

然后，用 75% 的酒精對凍存管外部進行消毒，以防止外界細菌、真菌等微生物污染細胞。在無菌操作臺內(nèi)，將凍存管內(nèi)的細胞懸液快速加入到含有適量培養(yǎng)基的離心管中，輕輕吹打混勻，使細胞均勻分散在培養(yǎng)基中。接下來進行離心操作，一般設(shè)定離心速度為 1000 - 1200rpm，離心時間為 5 分鐘左右，使細胞沉淀到離心管底部。離心完成后，小心棄去上清液，注意不要倒掉沉淀的細胞。加入新鮮的培養(yǎng)基，用移液管輕輕吹打細胞沉淀，使其重新懸浮在培養(yǎng)基中。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，輕輕晃動培養(yǎng)皿，使細胞均勻分布在整個培養(yǎng)皿表面，放入 37℃、5% CO? 的細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，讓細胞逐漸恢復(fù)活性并開始貼壁生長。在復(fù)蘇后的 24 小時內(nèi)，要密切觀察細胞的生長狀態(tài)，及時更換培養(yǎng)基，以確保細胞能夠順利適應(yīng)新的培養(yǎng)環(huán)境。

四、細胞培養(yǎng)過程中的觀察與記錄

定期觀察 iSCAP 細胞的生長狀態(tài)是細胞培養(yǎng)過程中的重要環(huán)節(jié)。通常每天至少觀察一次細胞，觀察內(nèi)容包括細胞的形態(tài)、顏色、細胞密度以及培養(yǎng)基的情況等。正常生長的 iSCAP 細胞呈多邊形或紡錘形，細胞邊緣清晰，胞質(zhì)均勻，顏色為淡黃色或透明，細胞之間相互連接成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。當(dāng)細胞生長良好時，細胞密度會逐漸增加，培養(yǎng)基的顏色可能會因為細胞代謝而略有變化，如由紅色逐漸變?yōu)槌壬虻S色。

若觀察到細胞顏色變深、渾濁，或者出現(xiàn)大量漂浮物，則可能提示細胞受到細菌、真菌或支原體等微生物的污染，或者細胞已經(jīng)死亡、變性。此時需要立即進行處理，如更換培養(yǎng)基、使用抗生素等，嚴重污染的細胞可能需要丟棄，以防止污染擴散到其他細胞培養(yǎng)體系中。

同時，要詳細記錄細胞的生長情況，包括細胞的形態(tài)變化、細胞密度的估計值（如以細胞占據(jù)培養(yǎng)皿面積的百分比表示）、培養(yǎng)基的更換時間、細胞傳代的時間和比例等信息。這些記錄有助于了解細胞的生長規(guī)律，為后續(xù)實驗安排提供參考，也有助于在出現(xiàn)問題時追溯原因，及時調(diào)整培養(yǎng)條件或采取相應(yīng)的解決措施。例如，通過觀察細胞在不同培養(yǎng)基成分下的生長情況，可以優(yōu)化培養(yǎng)基配方，提高細胞的生長質(zhì)量和實驗重復(fù)性。

五、細胞傳代的詳細步驟

當(dāng) iSCAP 細胞生長到培養(yǎng)皿面積的 80% - 90% 左右時，需要進行傳代操作，以避免細胞因密度過高而出現(xiàn)接觸抑制，影響細胞的正常生長和功能。傳代前，先用磷酸鹽緩沖液（PBS）輕輕沖洗培養(yǎng)皿中的細胞，目的是去除細胞表面殘留的培養(yǎng)基和一些可能影響細胞傳代的雜質(zhì)。沖洗時，將適量的 PBS 緩慢加入培養(yǎng)皿，輕輕晃動培養(yǎng)皿使 PBS 均勻覆蓋細胞表面，然后將 PBS 緩慢傾斜倒出，注意不要用力沖刷細胞，以免對細胞造成損傷。

接著，加入適量的胰蛋白酶 - EDTA 溶液（常用濃度為 0.25% 胰蛋白酶和 0.02% EDTA）到培養(yǎng)皿中，胰蛋白酶可以分解細胞間的黏附分子，使細胞從培養(yǎng)皿表面脫落。將培養(yǎng)皿放入 37℃、5% CO? 的培養(yǎng)箱中孵育 1 - 2 分鐘，期間要不時在顯微鏡下觀察細胞是否開始脫落。若細胞未全脫落，可輕輕敲擊培養(yǎng)皿的側(cè)壁，幫助細胞脫離培養(yǎng)皿表面。當(dāng)細胞大部分脫落形成細胞懸液后，立即加入適量的含血清培養(yǎng)基終止胰蛋白酶的作用，因為胰蛋白酶作用時間過長會對細胞造成損傷，影響細胞的活性和后續(xù)生長。

將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，進行離心（條件同前），棄去上清液后，加入新鮮的培養(yǎng)基，用移液管輕輕吹打，使細胞均勻分散在培養(yǎng)基中。按照適當(dāng)?shù)谋壤ㄈ?1:2 或 1:3）將細胞懸液分配到新的培養(yǎng)皿中，輕輕晃動培養(yǎng)皿使細胞均勻分布，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。傳代后的細胞需要特別關(guān)注前 24 小時的生長狀態(tài)，觀察細胞是否能夠正常貼壁、恢復(fù)生長，如有異常及時采取措施，如調(diào)整培養(yǎng)基成分、優(yōu)化培養(yǎng)條件等，以確保細胞的健康生長和實驗的順利進行。

六、細胞凍存的標準化流程

對于多余的細胞或需要長期保存的細胞系，凍存是常用的保存方法。凍存前，先用胰蛋白酶消化細胞并收集細胞懸液，離心后棄去上清液。加入適量的凍存液（一般凍存液的成分為 90% 胎牛血清和 10% 二甲基亞砜（DMSO）），輕輕吹打使細胞均勻分散在凍存液中。將細胞懸液分裝至凍存管中，每管一般裝 1 - 1.5ml。然后將凍存管放入程序降溫盒中，使細胞緩慢降溫。如果沒有程序降溫盒，可采用手動降溫的方法：先將凍存管放置在 4℃環(huán)境下 30 分鐘，再轉(zhuǎn)移到 - 20℃環(huán)境下放置 1 - 2 小時，最后轉(zhuǎn)移到 - 80℃冰箱中保存 2 - 3 小時，之后迅速將凍存管轉(zhuǎn)移到液氮罐中長期保存。這種緩慢降溫的程序可以減少細胞內(nèi)冰晶的形成，降低細胞在凍存過程中受到的損傷，提高細胞的復(fù)蘇率。在凍存過程中，要注意保持凍存管的密封性，防止水分進入導(dǎo)致細胞受損，同時做好凍存管的標記，注明細胞名稱、凍存日期等信息，以便后續(xù)使用時能夠快速準確地找到所需的細胞。

七、細胞實驗應(yīng)用的操作要點

（一）礦化誘導(dǎo)實驗操作

iSCAP 細胞在牙周組織礦化過程中具有重要的作用，礦化誘導(dǎo)實驗可用于研究細胞的礦化能力以及影響礦化的各種因素。在進行礦化誘導(dǎo)前，將細胞以適當(dāng)密度接種到培養(yǎng)皿中，待細胞貼壁后，更換為礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基。礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基通常在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加 β - 甘油磷酸鈉（終濃度一般為 10 mM 左右）、抗壞血酸（終濃度一般為 50 μg/ml 左右）和地塞米松（終濃度一般為 1 μM 左右）等誘導(dǎo)因子。β - 甘油磷酸鈉可提供礦化所需的磷酸鹽，抗壞血酸促進膠原合成，地塞米松則調(diào)節(jié)細胞的礦化相關(guān)基因表達，這些成分共同作用，模擬體內(nèi)礦化的微環(huán)境，誘導(dǎo)細胞向礦化表型分化。

在礦化誘導(dǎo)過程中，定期更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基（一般每 2 - 3 天更換一次），同時觀察細胞形態(tài)的變化以及檢測礦化相關(guān)標志物的表達情況?？梢酝ㄟ^茜素紅染色檢測細胞外基質(zhì)的礦化沉積情況。茜素紅是一種鈣鹽染料，能夠與礦化結(jié)節(jié)中的鈣鹽結(jié)合形成紅色的復(fù)合物。在礦化誘導(dǎo)一定時間（如 14 - 21 天）后，用 PBS 輕輕沖洗細胞，加入適量的茜素紅染液（一般濃度為 0.1% - 0.2%），在室溫下染色 10 - 15 分鐘。然后用去離子水沖洗掉未結(jié)合的染液，觀察并拍照記錄礦化結(jié)節(jié)的形成情況。通過比較不同實驗組和對照組的茜素紅染色結(jié)果，可以評估礦化誘導(dǎo)的效果以及各種因素對細胞礦化能力的影響，從而深入了解礦化過程的分子機制和調(diào)控因素，為牙周組織工程和牙髓再生等研究提供實驗依據(jù)。

（二）細胞因子分泌檢測實驗操作

iSCAP 細胞在牙周組織生理和病理過程中會分泌多種細胞因子，這些細胞因子在調(diào)節(jié)細胞行為、免疫反應(yīng)等方面起著重要作用。通過檢測 iSCAP 細胞分泌的細胞因子，可以深入了解其在不同刺激條件下的功能狀態(tài)。常用的細胞因子檢測方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）和蛋白質(zhì)芯片等。

在進行 ELISA 檢測時，首先根據(jù)實驗需求選擇合適的細胞因子檢測試劑盒，如檢測小鼠 RANKL（核因子 - κB 受體活化因子配體）或 OPG（骨保護素）等與骨代謝相關(guān)的細胞因子。將 iSCAP 細胞培養(yǎng)至一定密度后，用不含血清的培養(yǎng)基孵育細胞一段時間（如 24 - 48 小時），收集上清液作為待測樣本。按照試劑盒說明書的操作步驟，將樣本加入到預(yù)先包被有特異性抗體的酶標板孔中，經(jīng)過孵育、洗滌、加入酶標記二抗、顯色反應(yīng)等步驟，最后通過酶標儀測定吸光度值，根據(jù)標準曲線計算出細胞因子在樣本中的濃度。通過比較不同處理組和對照組的細胞因子分泌水平，可以分析各種因素（如藥物、炎癥因子等）對 iSCAP 細胞分泌功能的影響，從而探討其在牙周組織疾病發(fā)生發(fā)展中的作用機制，為開發(fā)新的治療策略提供線索。

（三）細胞與材料相互作用實驗操作

在牙周組織工程研究中，研究 iSCAP 細胞與生物材料的相互作用是一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。將 iSCAP 細胞種植到不同的生物材料表面（如羥基磷灰石、生物活性陶瓷等），可以觀察細胞在材料表面的黏附、增殖、分化以及細胞外基質(zhì)分泌等情況，從而評估材料的生物相容性和對牙周組織修復(fù)的支持作用。

在進行這類實驗時，首先需要對生物材料進行適當(dāng)?shù)奶幚砗蜏缇_保材料表面清潔、無毒且適合細胞生長。將材料樣品放置在培養(yǎng)皿或細胞培養(yǎng)板中，然后將細胞以適當(dāng)?shù)拿芏冉臃N到材料表面。在細胞培養(yǎng)箱中孵育一段時間后，通過掃描電子顯微鏡觀察細胞在材料表面的形態(tài)和分布情況，了解細胞與材料的初始黏附狀態(tài)。同時，可以采用一系列的細胞生物學(xué)檢測方法，如細胞計數(shù)試劑盒（CCK - 8）檢測細胞的增殖情況，阿爾辛藍染色檢測細胞外基質(zhì)中糖胺聚糖的分泌量，免疫熒光染色檢測細胞骨架蛋白（如 F - actin）的排列和相關(guān)分化標志蛋白（如 collagen type I）的表達等，綜合評估細胞與材料之間的相互作用效果。通過這些實驗，可以篩選出適合牙周組織工程應(yīng)用的生物材料，優(yōu)化材料的表面特性或組成，以提高細胞的活性和功能，加速牙周組織的修復(fù)和再生過程。