在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，永生化小鼠胚胎囊性纖維化成纖維細(xì)胞 - Ras（Immortalized Mouse Embryonic Cystic Fibrosis Fibroblasts - Ras）是一種具有價(jià)值的細(xì)胞模型，為深入探究相關(guān)疾病機(jī)制及藥物篩選提供了有力支持。以下是關(guān)于該細(xì)胞系操作使用的詳細(xì)指南。

一、細(xì)胞培養(yǎng)條件

（一）培養(yǎng)基配制

該細(xì)胞系通常使用改良 Eagle 培養(yǎng)基（DMEM）進(jìn)行培養(yǎng)，需在培養(yǎng)基中添加 10% 胎牛血清（FBS），以提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、激素和生長(zhǎng)因子等，還需添加 1% 青霉素 - 鏈霉素雙抗溶液，防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)菌和真菌污染。

（二）培養(yǎng)環(huán)境

細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)在 37℃、5% CO?的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行，這樣的環(huán)境有助于維持培養(yǎng)基的 pH 值穩(wěn)定，并為細(xì)胞提供適宜的生長(zhǎng)溫度和氣體條件，以模擬體內(nèi)生理環(huán)境，確保細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和代謝。

二、細(xì)胞傳代操作

（一）傳代比例

一般建議將細(xì)胞以 1:2 至 1:3 的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶底面積的 80%-90% 時(shí)，即可進(jìn)行傳代操作，以防止細(xì)胞過度擁擠導(dǎo)致生長(zhǎng)抑制和細(xì)胞狀態(tài)下降。

（二）胰酶消化

使用 0.25% 的胰蛋白酶 - EDTA 溶液進(jìn)行細(xì)胞消化。在消化過程中，需密切觀察細(xì)胞形態(tài)變化，一般在 37℃下消化 1-2 分鐘，待細(xì)胞間隙增大、細(xì)胞邊緣變圓并開始從培養(yǎng)瓶壁上脫落時(shí)，立即加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞使其全脫落并形成均勻的細(xì)胞懸液，然后進(jìn)行分瓶培養(yǎng)。

三、細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

（一）細(xì)胞凍存

1. 凍存培養(yǎng)基配制 ：凍存培養(yǎng)基一般由基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）和二甲基亞砜（DMSO）組成，比例為 50% 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 + 40% FBS + 10% DMSO。DMSO 是一種常用的細(xì)胞凍存保護(hù)劑，可降低細(xì)胞內(nèi)外溶液的冰點(diǎn)，減少細(xì)胞內(nèi)水分結(jié)冰對(duì)細(xì)胞造成的損傷。

2. 凍存操作 ：將細(xì)胞收集并離心，棄去上清液，用凍存培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至 1×10^6^ cells/mL 左右，將細(xì)胞懸液分裝于凍存管中，每管 1 mL。將凍存管置于程序降溫盒中，放入 - 80℃冰箱中過夜，次日轉(zhuǎn)移至液氮中長(zhǎng)期保存。緩慢降溫的過程有助于細(xì)胞逐漸適應(yīng)低溫環(huán)境，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而提高細(xì)胞復(fù)蘇后的存活率。

（二）細(xì)胞復(fù)蘇

1. 快速解凍 ：從液氮中取出凍存管，立即放入 37℃水浴中快速搖動(dòng)，使細(xì)胞在 45-90 秒內(nèi)全解凍?？焖俳鈨隹墒辜?xì)胞迅速通過最易受損的溫度區(qū)域，減少細(xì)胞在低溫條件下受凍的時(shí)間，降低細(xì)胞受損程度。

2. 細(xì)胞處理 ：將凍存管從水浴中取出后，用 70% 酒精消毒管外壁，移入無菌超凈工作臺(tái)內(nèi)。將凍存管中的細(xì)胞懸液全部轉(zhuǎn)移到含有 9 mL 培養(yǎng)基的離心管中，用移液管輕輕吹打混勻，使凍存管中的 DMSO 濃度稀釋至 10% 以下，以減少 DMSO 對(duì)細(xì)胞的毒性作用。然后在 300×g 的離心力下離心 3 分鐘，棄去上清液，加入適量培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，放入 37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

四、細(xì)胞基因改造機(jī)制

該細(xì)胞系是通過將 Ras 基因?qū)胄∈笈咛ツ倚岳w維化成纖維細(xì)胞而獲得永生化。Ras 基因是一種原癌基因，可編碼 21kD 的 GTP 酶。正常細(xì)胞中，Ras 蛋白處于活性狀態(tài)時(shí)，能夠結(jié)合 GTP 并激活下游的信號(hào)通路，如 MAPK 信號(hào)通路，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等生理過程的調(diào)控。而在該細(xì)胞系中，Ras 基因的異常表達(dá)或激活可破壞細(xì)胞正常的生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制，使細(xì)胞獲得無限增殖的能力，從而實(shí)現(xiàn)永生化。

五、細(xì)胞應(yīng)用

（一）疾病研究模型

永生化小鼠胚胎囊性纖維化成纖維細(xì)胞 - Ras 是研究囊性纖維化疾病的重要細(xì)胞模型。通過在體外模擬囊性纖維化的病理環(huán)境，可深入探究該疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，如細(xì)胞的異常增殖、凋亡抗性以及與炎癥反應(yīng)等的關(guān)系，為開發(fā)針對(duì)性的治療方法提供理論基礎(chǔ)。

（二）藥物篩選

該細(xì)胞系可用于高通量藥物篩選，用于篩選能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或改善囊性纖維化相關(guān)病理特征的藥物。由于細(xì)胞具有永生化特性，可在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定地進(jìn)行藥物處理和實(shí)驗(yàn)觀察，提高了藥物篩選的效率和可靠性。