在神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域，永生化大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞 - SV40（Immortalized Rat Brain Microvascular Endothelial Cells - SV40）是一種具價(jià)值的細(xì)胞模型，為深入探究血腦屏障機(jī)制及相關(guān)疾病提供了有力支持。以下是關(guān)于該細(xì)胞系操作使用的詳細(xì)指南。

一、細(xì)胞培養(yǎng)條件

（一）培養(yǎng)基配制

該細(xì)胞系通常使用內(nèi)皮細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，如 ECM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 +5% 胎牛血清（FBS）+ 內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑。培養(yǎng)基中需添加青霉素 - 鏈霉素雙抗溶液，防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌和真菌污染。

（二）培養(yǎng)環(huán)境

細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)在 37℃、5% CO?的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行，這樣的環(huán)境有助于維持培養(yǎng)基的 pH 值穩(wěn)定，并為細(xì)胞提供適宜的生長(zhǎng)溫度和氣體條件，以模擬體內(nèi)生理環(huán)境，確保細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和代謝。

二、細(xì)胞傳代操作

（一）傳代比例

一般建議將細(xì)胞以 1:2 至 1:3 的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶底面積的 80%-90% 時(shí)，即可進(jìn)行傳代操作，以防止細(xì)胞過(guò)度擁擠導(dǎo)致生長(zhǎng)抑制和細(xì)胞狀態(tài)下降。

（二）胰酶消化

使用 0.25% 的胰蛋白酶 - EDTA 溶液進(jìn)行細(xì)胞消化。在消化過(guò)程中，需密切觀察細(xì)胞形態(tài)變化，一般在 37℃下消化 1-3 分鐘，待細(xì)胞間隙增大、細(xì)胞邊緣變圓并開(kāi)始從培養(yǎng)瓶壁上脫落時(shí)，立即加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞使其全脫落并形成均勻的細(xì)胞懸液，然后進(jìn)行分瓶培養(yǎng)。

三、細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

（一）細(xì)胞凍存

1. 凍存培養(yǎng)基配制 ：凍存培養(yǎng)基一般由基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）和二甲基亞砜（DMSO）組成，比例為 90% FBS + 10% DMSO。

2. 凍存操作 ：將細(xì)胞收集并離心，棄去上清液，用凍存培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至 5×10^6^-1×10^7^ cells/mL 左右，將細(xì)胞懸液分裝于凍存管中，每管 1 mL。將凍存管置于程序降溫盒中，放入 - 80℃冰箱中過(guò)夜，次日轉(zhuǎn)移至液氮中長(zhǎng)期保存。緩慢降溫的過(guò)程有助于細(xì)胞逐漸適應(yīng)低溫環(huán)境，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而提高細(xì)胞復(fù)蘇后的存活率。

（二）細(xì)胞復(fù)蘇

1. 快速解凍 ：從液氮中取出凍存管，立即放入 37℃水浴中快速搖晃解凍，使細(xì)胞在 45-90 秒內(nèi)全解凍。

2. 細(xì)胞處理 ：將凍存管從水浴中取出后，用 70% 酒精消毒管外壁，移入無(wú)菌超凈工作臺(tái)內(nèi)。將凍存管中的細(xì)胞懸液全部轉(zhuǎn)移到含有 9 mL 全培養(yǎng)基的離心管中，用移液管輕輕吹打混勻，使凍存管中的 DMSO 濃度稀釋至 10% 以下，以減少 DMSO 對(duì)細(xì)胞的毒性作用。然后在 1000rpm 條件下離心 3-5 分鐘，棄去上清液，加入適量全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，放入 37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

四、細(xì)胞基因改造機(jī)制

該細(xì)胞系是通過(guò)將 SV40 大 T 抗原基因?qū)氪笫竽X微血管內(nèi)皮細(xì)胞而獲得永生化。SV40 大 T 抗原能夠與細(xì)胞內(nèi)的多種蛋白質(zhì)相互作用，其中包括視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（RB）和 p53 蛋白。正常情況下，RB 蛋白通過(guò)與 E2F 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，抑制細(xì)胞周期相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞停滯在 G1 期，阻止細(xì)胞進(jìn)入 S 期進(jìn)行 DNA 復(fù)制，從而抑制細(xì)胞增殖。而 p53 蛋白則是一種重要的腫瘤抑制蛋白，在細(xì)胞受到 DNA 損傷等應(yīng)激信號(hào)時(shí)，p53 蛋白可激活相關(guān)基因的表達(dá)，使細(xì)胞周期停滯，為 DNA 修復(fù)提供時(shí)間，若 DNA 損傷無(wú)法修復(fù)，p53 蛋白則會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，以維持細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性。然而，SV40 大 T 抗原可以分別與 RB 蛋白和 p53 蛋白結(jié)合，使其失去正常的生理功能，細(xì)胞周期調(diào)控失效，細(xì)胞得以突破正常的增殖限制，實(shí)現(xiàn)無(wú)限增殖。

五、細(xì)胞應(yīng)用

（一）血腦屏障機(jī)制研究

永生化大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞 - SV40 是研究血腦屏障機(jī)制的重要細(xì)胞模型。血腦屏障是由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、周細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞足突等組成的復(fù)合體，具有限制物質(zhì)從血液進(jìn)入大腦的作用，對(duì)維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定至關(guān)重要。通過(guò)使用該細(xì)胞系，可深入探究血腦屏障的形成、維持以及在病理狀態(tài)下的改變機(jī)制，如細(xì)胞間緊密連接的形成與調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的功能等。

（二）藥物滲透性測(cè)試

該細(xì)胞系可用于藥物穿透血腦屏障的研究。在藥物研發(fā)過(guò)程中，了解藥物能否有效穿透血腦屏障是開(kāi)發(fā)治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。將永生化大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞 - SV40 培養(yǎng)在特殊的實(shí)驗(yàn)裝置中，如 Transwell 小室，模擬血腦屏障的結(jié)構(gòu)和功能，然后將藥物加入到上室，通過(guò)檢測(cè)藥物在下室的濃度變化，評(píng)估藥物的滲透性，為篩選能夠有效透過(guò)血腦屏障的藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。