永生化犬真皮成纖維細(xì)胞 - hTERT 是一種重要的細(xì)胞模型，以下是其操作使用方面的詳細(xì)指南。

一、細(xì)胞培養(yǎng)條件

（一）培養(yǎng)基配制

該細(xì)胞系推薦使用 DMEM 高糖型培養(yǎng)基，其中添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素 - 鏈霉素雙抗溶液。FBS 能為細(xì)胞生長(zhǎng)提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、激素和生長(zhǎng)因子等，而雙抗溶液則可有效防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)菌和真菌污染。

（二）培養(yǎng)環(huán)境

細(xì)胞應(yīng)在 37℃、5% CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。此環(huán)境有助于維持培養(yǎng)基的 pH 值穩(wěn)定，同時(shí)為細(xì)胞提供適宜的生長(zhǎng)溫度和氣體條件，使其 metabolic processes 運(yùn)行更貼近體內(nèi)生理環(huán)境，從而確保細(xì)胞正常生長(zhǎng)和代謝。

二、細(xì)胞傳代操作

（一）傳代比例

建議將細(xì)胞以 1:3 至 1:4 的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶底面積的 80% - 90% 時(shí)，即可進(jìn)行傳代，以避免細(xì)胞過度擁擠導(dǎo)致生長(zhǎng)抑制和細(xì)胞狀態(tài)下降。

（二）胰酶消化

使用 0.25% 的胰蛋白酶 - EDTA 溶液進(jìn)行細(xì)胞消化。消化時(shí)，需密切觀察細(xì)胞形態(tài)變化，一般在 37℃下消化 1 - 3 分鐘，待細(xì)胞間隙增大、細(xì)胞邊緣變圓并開始從培養(yǎng)瓶壁上脫落時(shí)，立即加入含血清的培養(yǎng)基終止消化。然后輕輕吹打細(xì)胞，使其全脫落并形成均勻的細(xì)胞懸液，再進(jìn)行分瓶培養(yǎng)。

三、細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

（一）細(xì)胞凍存

凍存培養(yǎng)基一般由基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）和二甲基亞砜（DMSO）組成，比例為 90% FBS + 10% DMSO。將細(xì)胞收集并離心，棄去上清液后，用凍存培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至 5×10? - 1×10? cells/mL 左右，分裝于凍存管中，每管 1 mL。將凍存管置于程序降溫盒中，放入 - 80℃冰箱中過夜，次日轉(zhuǎn)移至液氮中長(zhǎng)期保存。緩慢降溫有助于細(xì)胞逐漸適應(yīng)低溫環(huán)境，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而提高細(xì)胞復(fù)蘇后的存活率。

（二）細(xì)胞復(fù)蘇

從液氮中取出凍存管，立即放入 37℃水浴中快速搖晃解凍，使細(xì)胞在 1 分鐘左右全解凍。用 70% 酒精消毒管外壁后，移入無菌超凈工作臺(tái)內(nèi)。將凍存管中的細(xì)胞懸液全部轉(zhuǎn)移到含有 9 mL 全培養(yǎng)基的離心管中，用移液管輕輕吹打混勻，使 DMSO 濃度稀釋至 10% 以下，以降低其對(duì)細(xì)胞的毒性。接著在 1000rpm 條件下離心 5 分鐘，棄去上清液，加入適量全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，放入 37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

四、細(xì)胞基因改造機(jī)制

該細(xì)胞系是通過將 hTERT 基因?qū)肴嫫こ衫w維細(xì)胞而獲得永生化。正常細(xì)胞的分裂次數(shù)有限，這是因?yàn)槊看渭?xì)胞分裂時(shí)，染色體末端的端粒會(huì)縮短，當(dāng)端?？s短到一定程度時(shí)，細(xì)胞就會(huì)進(jìn)入衰老狀態(tài)并停止分裂。而 hTERT 基因是端粒酶的催化亞基，可使端粒延長(zhǎng)，從而維持細(xì)胞的增殖能力，使細(xì)胞突破正常的增殖極限，實(shí)現(xiàn)無限增殖。

五、細(xì)胞應(yīng)用

（一）皮膚修復(fù)研究

永生化犬真皮成纖維細(xì)胞 - hTERT 是研究皮膚修復(fù)機(jī)制的重要細(xì)胞模型。成纖維細(xì)胞在皮膚損傷后的修復(fù)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它們參與細(xì)胞外基質(zhì)的合成與重塑，促進(jìn)傷口愈合。利用該細(xì)胞系，可深入探究影響皮膚修復(fù)的各種因素，如細(xì)胞生長(zhǎng)因子、信號(hào)通路等，為開發(fā)促進(jìn)皮膚再生和修復(fù)的治療方法提供理論基礎(chǔ)。

（二）藥物篩選

該細(xì)胞系可用于藥物篩選，用于篩選能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、促進(jìn)皮膚修復(fù)或改善皮膚相關(guān)疾病病理特征的藥物。由于細(xì)胞具有永生化特性，可在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定地進(jìn)行藥物處理和實(shí)驗(yàn)觀察，提高了藥物篩選的效率和可靠性。