大腦具有驚人的分子多樣性，這種多樣性不僅是神經(jīng)元復(fù)雜結(jié)構(gòu)特化的基礎(chǔ)，也支撐著神經(jīng)元間復(fù)雜的連接與突觸傳遞。要理解這些分子的功能，關(guān)鍵在于解析眾多蛋白的精確定位及其空間關(guān)系。然而，神經(jīng)元精細(xì)結(jié)構(gòu)內(nèi)組分高度密集，傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡約200 nm的衍射極限阻礙了此類信息的獲取。

超分辨率成像技術(shù)突破了200 nm的傳統(tǒng)光學(xué)衍射極限，單分子定位技術(shù)（SMLM）具有20 nm的超高空間分辨率，是研究單個(gè)分子定位、蛋白相互作用等的理想工具，可以實(shí)現(xiàn)大分子復(fù)合物的原位可視化。該技術(shù)可應(yīng)用于諸如突觸活動(dòng)區(qū)的分子組織，生長(zhǎng)錐和樹(shù)突棘中肌動(dòng)蛋白的排列與膜運(yùn)輸機(jī)制，單分子水平的突觸傳遞與可塑性，腦回路的納米級(jí)結(jié)構(gòu)和軸突質(zhì)膜下肌動(dòng)蛋白和血影蛋白細(xì)胞骨架的顯著周期性等不同研究中。

Abbelight 3D單分子超分辨成像系統(tǒng)依托前沿的單分子定位顯微成像技術(shù)（SMLM），實(shí)現(xiàn)xyz三軸15 nm的超高分辨率，支持同時(shí)多色成像；該系統(tǒng)支持 STORM、PALM、PAINT 等單分子定位技術(shù)，并融入ASTER大視野成像、光譜拆分多色成像及Ultimate 3D成像技術(shù)，構(gòu)建了一個(gè)強(qiáng)大易用的一體化平臺(tái)，助力神經(jīng)科學(xué)家準(zhǔn)確解析神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的納米級(jí)分子機(jī)制。

3D單分子超分辨成像系統(tǒng)

本文將從納米級(jí)突觸表型檢測(cè)、膜相關(guān)周期性骨架和軸突起始段的結(jié)構(gòu)組成三方面應(yīng)用入手，介紹Abbelight 3D單分子超分辨成像系統(tǒng)在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

納米級(jí)突觸表型檢測(cè)

圖1   突觸的多通道成像

橙色：囊泡GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；藍(lán)色：Bassoon管蛋白

不同突觸間神經(jīng)遞質(zhì)釋放的過(guò)程存在顯著差異，為探究這種差異是否與釋放過(guò)程中蛋白質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)有關(guān)，J. Burrone 等^[1] 利用Abbelight 3D單分子超分辨成像系統(tǒng)，通過(guò)多色單分子定位技術(shù)對(duì)SypHy-RGECO（一種能同步檢測(cè)突觸前鈣離子內(nèi)流與神經(jīng)遞質(zhì)釋放的雙重報(bào)告蛋白）進(jìn)行成像，旨在研究單個(gè)突觸前小體的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系。

通過(guò) Cav2.1 和巴松管蛋白（Bassoon）與 SypHy-RGECO的雙色 dSTORM 超分辨成像，研究者發(fā)現(xiàn)這兩種活性區(qū)蛋白均以亞突觸結(jié)構(gòu)域（SSDs）的形式存在。在代表單個(gè)突觸前小體的 SypHy-RGECO 團(tuán)簇內(nèi)，可包含 1 至 6 個(gè) Cav2.1   SSD（均值=1.6，圖 2A）或 Bassoon SSDs（均值=1.7，圖 2B）。利用基于單分子檢測(cè)密度的分析軟件 Point Cloud Analyst 分析表明：含多個(gè)Cav2.1 SSDs的突觸，其SypHy 團(tuán)簇體積更大（圖 2C）；含多個(gè)Bassoon SSDs的突觸，其SypHy 團(tuán)簇體積差異更為顯著（圖 2D）。

這些結(jié)果表明，突觸可通過(guò)不同方式組織蛋白：既可形成單個(gè)SSD，也可構(gòu)建具有不同密度的多個(gè)SSD。此類精細(xì)結(jié)構(gòu)在傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡下無(wú)法觀測(cè)，凸顯了單分子定位技術(shù)在揭示突觸蛋白組織機(jī)制方面難以超越的優(yōu)勢(shì)，而 Abbelight 3D 單分子超分辨成像系統(tǒng)憑借其超高分辨率，為觀測(cè)此類精細(xì)結(jié)構(gòu)提供了有力支撐。

圖2   SypHy-RGECO團(tuán)簇內(nèi)的Cav2.1和Bassoon

J. Burrone等之后的一項(xiàng)研究^[2]表明，海馬CA1區(qū)基底樹(shù)突在起層（stratum oriens）形成的突觸中，約半數(shù)屬于多突觸小泡（MSB）—— 即單個(gè)突觸前小泡與來(lái)自不同細(xì)胞的多個(gè)（2-7個(gè)）突觸后棘形成興奮性連接。這類突觸數(shù)量龐大且具有特殊形態(tài)，此外單個(gè)MSB內(nèi)部各突觸接觸點(diǎn)的特性差異，遠(yuǎn)小于相鄰單突觸小泡（SSB）之間的異質(zhì)性，這表明MSB通過(guò)其眾多接觸點(diǎn)傳遞相似的信息，暗示它們可能在促進(jìn)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)同步化活動(dòng)中發(fā)揮作用。

研究人員使用STORM技術(shù)對(duì)標(biāo)記了兩種突觸前分子 —— vGlut-1和Bassoon進(jìn)行成像，分析多個(gè)樣本中MSB的分布情況（圖3）。結(jié)果顯示，vGlut-1呈現(xiàn)出突觸終端前小泡輪廓，而B(niǎo)assoon染色則如預(yù)期呈現(xiàn)更明顯的點(diǎn)狀分布（圖3A、3B）。通過(guò)Abbelight Neo軟件的團(tuán)簇分析功能發(fā)現(xiàn)，相較于SSB，MSB的vGlut團(tuán)簇具有更大的體積（圖3C），但Bassoon團(tuán)簇體積無(wú)顯著變化（圖3D）。更重要的是，MSB內(nèi)部的Bassoon團(tuán)簇體積離散度顯著低于不同SSB間的離散度（圖3E），這與MSBs活性區(qū)尺寸變異減小的測(cè)量結(jié)果一致。這些數(shù)據(jù)共同表明，MSBs通過(guò)各接觸點(diǎn)向多個(gè)細(xì)胞傳遞相似的信息，而 Abbelight 3D 單分子超分辨成像系統(tǒng)的精準(zhǔn)成像和配套分析軟件的強(qiáng)大功能，為該研究結(jié)論的得出提供了可靠依據(jù)。

圖3   多突觸小泡內(nèi)部活性區(qū)的特性相似度顯著高于單突觸小泡

J. Burrone等的另一項(xiàng)研究^[3]發(fā)現(xiàn)，在發(fā)育中的海馬CA1神經(jīng)元基底樹(shù)突上，興奮性和抑制性突觸的分布呈現(xiàn)高度相關(guān)性。這種緊密關(guān)聯(lián)在神經(jīng)元發(fā)育早期（P7階段）最為顯著——此時(shí)抑制性突觸在分子和生理功能上均未成熟，而隨著興奮性突觸密度的增加，兩者的相關(guān)性會(huì)逐漸減弱。

研究人員發(fā)現(xiàn)，P7階段神經(jīng)遞質(zhì)釋放失敗率相較于更成熟的P21階段更高。為深入探究這一現(xiàn)象，研究人員使用dSTORM對(duì)vGAT標(biāo)記的突觸前小泡進(jìn)行超分辨率成像（圖4A），發(fā)現(xiàn)vGAT點(diǎn)狀團(tuán)簇結(jié)構(gòu)的體積在各階段均無(wú)顯著差異（圖4B），證實(shí)抑制性突觸在發(fā)育過(guò)程中未發(fā)生明顯變化。接下來(lái)對(duì)普遍存在于所有突觸小泡的活性區(qū)標(biāo)志物Bassoon進(jìn)行成像（圖4C）并用Abbelight Neo軟件進(jìn)行共定位分析，發(fā)現(xiàn)在P7階段僅有約40%的內(nèi)源性vGAT（白色）點(diǎn)狀團(tuán)簇含有Bassoon（紅色）（圖4C行2）或另一關(guān)鍵活性區(qū)蛋白R(shí)IM1/2（紅色）（圖4C行3）。到P10階段時(shí)，絕大多數(shù)（約90%）vGAT陽(yáng)性突觸已能清晰標(biāo)記這兩種活性區(qū)標(biāo)志物，且這種共定位在P21階段仍保持高度穩(wěn)定（圖4C）。以上結(jié)果表明，在P7階段，基底樹(shù)突上的大多數(shù)抑制性突觸尚未成熟，其活性區(qū)未完全形成。Abbelight   3D 單分子超分辨成像系統(tǒng)的高分辨率成像能力和精準(zhǔn)的共定位分析功能，使得這種突觸發(fā)育過(guò)程中的細(xì)微變化得以清晰呈現(xiàn)。

圖4   抑制性突觸早期發(fā)育時(shí)的組成變化

膜相關(guān)周期性骨架

C. Leterrier等^[4]通過(guò)多種單分子定位超分辨顯微技術(shù)，借助神經(jīng)元培養(yǎng)體系中經(jīng)驗(yàn)證的微珠誘導(dǎo)突觸前膜模型，實(shí)現(xiàn)了對(duì)突觸前肌動(dòng)蛋白的納米級(jí)結(jié)構(gòu)解析和定量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了一類主要的肌動(dòng)蛋白富集型突觸前膜，存在三種特征性的肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)：活躍區(qū)域的肌動(dòng)蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（actin mesh）、連接活躍區(qū)與深層儲(chǔ)備池的肌動(dòng)蛋白軌道狀結(jié)構(gòu)（actin   rails），以及環(huán)繞整個(gè)突觸前區(qū)的肌動(dòng)蛋白圍欄狀結(jié)構(gòu)（actin corrals）。這類突觸不僅聚集了更多突觸前組分，其突觸小泡循環(huán)速率也顯著高于非富集型突觸。

為精確解析肌動(dòng)蛋白與突觸前組分的空間關(guān)系，研究人員采用了三色STORM/PAINT聯(lián)用成像技術(shù)：先通過(guò)STORM對(duì)肌動(dòng)蛋白成像，再運(yùn)用雙色DNA-PAINT技術(shù)分別標(biāo)記沿軸突干形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的血影蛋白β2-spectrin和勾勒突觸小泡群的突觸素synapsin。結(jié)果證實(shí)血影蛋白膜下支架終止于突觸小泡處，而肌動(dòng)蛋白圍欄結(jié)構(gòu)包裹著突觸小泡團(tuán)簇，其軌道狀結(jié)構(gòu)指向活性區(qū)（圖5A）。通過(guò)STORM納米成像比較肌動(dòng)蛋白富集型（A+）與非富集型（A-）誘導(dǎo)突觸前膜的差異顯示，A+與A-型誘導(dǎo)突觸前膜均含有三種肌動(dòng)蛋白納米結(jié)構(gòu)（網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、軌道狀結(jié)構(gòu)和圍欄狀結(jié)構(gòu)）（圖5B）。進(jìn)一步檢測(cè)包被微珠誘導(dǎo)的興奮性與抑制性突觸前膜是否均存在這三類肌動(dòng)蛋白納米結(jié)構(gòu)，通過(guò)抗VGLUT與VGAT抗體標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，兩類誘導(dǎo)突觸前膜的肌動(dòng)蛋白納米結(jié)構(gòu)無(wú)定性差異，絕大多數(shù)都含有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、軌道狀結(jié)構(gòu)和圍欄狀結(jié)構(gòu)（圖5E-F）。Abbelight 3D 單分子超分辨成像系統(tǒng)支持多種成像模式，能夠精準(zhǔn)解析復(fù)雜的分子空間關(guān)系，為研究膜相關(guān)周期性骨架提供了強(qiáng)大的技術(shù)支持。

圖5   各類誘導(dǎo)型突觸前膜中均存在肌動(dòng)蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、軌道狀結(jié)構(gòu)與圍欄狀結(jié)構(gòu)。

軸突起始段的結(jié)構(gòu)組成

在哺乳動(dòng)物的軸突性樹(shù)突（AcD）神經(jīng)元中，軸突并非起源于胞體，而是從基底樹(shù)突發(fā)出，進(jìn)而在軸突起始段（AIS）形成動(dòng)作電位產(chǎn)生的特化通路。然而目前尚不明確這種特殊形態(tài)是如何建立的，以及AcD神經(jīng)元中AIS的結(jié)構(gòu)與功能是否得以保留。

K. Grünewald等^[5]采用離體海馬神經(jīng)元培養(yǎng)模型，發(fā)現(xiàn)AcD形態(tài)的發(fā)育可發(fā)生在突觸形成之前，且不依賴于體內(nèi)環(huán)境。單個(gè)前體神經(jīng)突首先形成軸突，隨后發(fā)育為AcD。該AIS具有與胞體源AIS相似的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，同樣作為運(yùn)輸屏障維持軸突特異性分子組成。然而，它不經(jīng)歷穩(wěn)態(tài)可塑性，所含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池狀細(xì)胞器（cisternal organelles）更少，并且接收的抑制性輸入也較少。這些結(jié)果揭示了AcD神經(jīng)元的生物學(xué)特性，并表明了AIS結(jié)構(gòu)特征可能因軸突起源不同而存在差異。

軸突起始段（AIS）的另一結(jié)構(gòu)特征是包含膜相關(guān)周期性骨架（MPS）的膜下F-actin環(huán)以及胞內(nèi)F-actin斑塊。研究人員為深入解析膜相關(guān)周期性骨架MPS的結(jié)構(gòu)特征，在AcD神經(jīng)元中進(jìn)行了βIV-spectrin與F-actin的dSTORM成像，發(fā)現(xiàn)其軸突起始段（AIS）的βIV-血影蛋白同樣形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，相鄰條帶間距約196 nm，且F-肌動(dòng)蛋白與βIV-血影蛋白條帶呈互補(bǔ)分布模式（圖6），該結(jié)果與非AcD神經(jīng)元的既往研究一致，表明AcD神經(jīng)元中樹(shù)突起源的軸突并未改變其AIS區(qū)域的微管和MPS的納米結(jié)構(gòu)。Abbelight 3D 單分子超分辨成像系統(tǒng)的高分辨率和精準(zhǔn)的成像能力，讓軸突起始段這種精細(xì)的結(jié)構(gòu)組成得以清晰展示。

圖6   使用Abbelight光譜拆分技術(shù)實(shí)現(xiàn)軸突起始段的多通道成像

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