定量蛋白質(zhì)組學的核心是利用質(zhì)譜（MS）在不同實驗條件下準確測量蛋白質(zhì)的豐度。質(zhì)譜的高分辨率和高靈敏度可以精確量化蛋白質(zhì)的表達水平，結(jié)合一些定量方法還可以同時分析多個樣本。zuì cháng yòng的策略包括非標記定量和標記定量。

一、非標記定量蛋白質(zhì)組學

非標記定量是指不依賴任何化學或同位素標記的定量方法。蛋白質(zhì)豐度是通過肽段的信號強度或譜計數(shù)來計算的。常用的非標記定量方法包括基于信號強度的定量和譜計數(shù)。

1、基于信號強度的定量

基于信號強度的定量通過測量質(zhì)譜儀中檢測到的肽離子的強度來進行定量，假設肽離子的強度與其豐度成正比。在這種方法中，蛋白質(zhì)經(jīng)過酶解變?yōu)殡亩危ㄟ^液相色譜分離，并用質(zhì)譜進行分析。每個肽段的信號強度反映了其相對豐度，隨后用于估算樣本之間蛋白質(zhì)表達的變化。這種方法簡單、成本效益高，適合大規(guī)模和復雜樣本的分析。然而，信號強度的準確性可能會受到離子化效率和樣本復雜度差異的影響。

2、譜計數(shù)

譜計數(shù)通過統(tǒng)計每個蛋白質(zhì)匹配到的MS/MS譜圖的數(shù)量來估算蛋白質(zhì)豐度。在質(zhì)譜分析過程中，蛋白質(zhì)被消化成肽段，這些肽段被碎裂并以譜圖的形式檢測。每個蛋白質(zhì)的譜圖數(shù)量與其豐度成正比。譜計數(shù)方法簡單且具有高通量，常用于相對定量。然而，它存在一些限制：對離子化效率敏感，對低豐度蛋白質(zhì)的準確性較差，且無法提供絕對定量。此外，其準確性高度依賴于參考數(shù)據(jù)庫的完整性。

圖1. 非標記定量蛋白質(zhì)組學工作流程

3、4D非標記定量蛋白質(zhì)組學

4D非標記定量蛋白質(zhì)組學將離子遷移譜（IM）和數(shù)據(jù)獨立采集（DIA）技術(shù)結(jié)合，用于高分辨率、高通量的蛋白質(zhì)定量。該方法整合了四維分離—保留時間、質(zhì)荷比（m/z）、離子強度和離子遷移性—提高了選擇性和分辨率。通常在像Bruker timsTOF Pro這類儀器上使用diaPASEF（平行積累–串行碎裂）采集方法。工作流程包括蛋白質(zhì)提取、酶解、液相色譜分離、離子遷移分離、質(zhì)譜檢測以及下游生物信息學分析。該方法不需要任何標記，因此適用于多種生物樣本類型。

Jiang, H. et al. BMC Pregnancy and Childbirth, 2024.

圖2. 4D非標記定量蛋白質(zhì)組學工作流程

4D非標記定量蛋白質(zhì)組學顯著提高了低豐度蛋白質(zhì)和結(jié)構(gòu)相似肽段的識別，改進了定量的準確性，并增加了重復性。其非標記特性確保了更低的成本和更簡便的工作流程，適用于大規(guī)模研究。然而，這一方法需要特定的儀器和強大的數(shù)據(jù)分析能力，并且在批次間比較方面可能不如TMT或iTRAQ有效。它更適合深入的基礎研究和動態(tài)蛋白質(zhì)組譜分析，而不是標準化的臨床應用。

二、標記定量蛋白質(zhì)組學

在討論完非標記定量的優(yōu)勢和挑戰(zhàn)后，我們接下來探討標記定量策略。標記定量依賴化學或同位素標簽來量化蛋白質(zhì)豐度。這些策略通常提供更高的準確性，非常適合多個樣本之間的比較分析。

1、SILAC（細胞培養(yǎng)中氨基酸的穩(wěn)定同位素標記）

SILAC是一種代謝標記技術(shù)，通過向培養(yǎng)細胞中添加穩(wěn)定同位素標記的氨基酸，在合成過程中標記蛋白質(zhì)。通過在細胞培養(yǎng)基中補充同位素標記的賴氨酸或精氨酸（如15N標記），蛋白質(zhì)自然地將這些標簽納入其中。酶解后標記和未標記的肽段可以通過它們在質(zhì)譜中的質(zhì)量差異進行區(qū)分。SILAC能夠?qū)崿F(xiàn)高度準確的定量，并且在分析復雜生物基質(zhì)中的低豐度蛋白質(zhì)時特別有用。

Chen, X. et al. Proteomics, 2015.

圖3. SILAC定量蛋白質(zhì)組學工作流程

SILAC具有高靈敏度和精度，廣泛適用于各種生物學模型。然而，它也有一些限制，比如試劑成本較高，且需要高性能的質(zhì)譜平臺和數(shù)據(jù)處理能力。

2、iTRAQ（同位素標記相對和絕對定量）

iTRAQ是一種化學標記技術(shù)，使用同位素標簽進行多個樣本中蛋白質(zhì)的相對和絕對定量。每個iTRAQ標簽包含一個報告基團和一個反應基團。在質(zhì)譜/質(zhì)譜分析過程中，標簽碎裂并釋放出dú tè的報告離子，這些報告離子的強度反映了來自不同樣本的肽段的豐度。iTRAQ允許在一次運行中同時分析多達8個樣本，從而顯著提高通量。

圖4. iTRAQ標簽結(jié)構(gòu)

iTRAQ因其一致的MS1質(zhì)量值和dú tè的MS2報告離子進行定量，提供了高準確性和重復性。它廣泛用于疾病研究、藥物開發(fā)和生物標志物發(fā)現(xiàn)。然而，iTRAQ的成本較高，并且在復雜樣本中可能會受到報告離子干擾，影響定量精度。正確的標記和樣本準備對可靠結(jié)果至關(guān)重要。

3、TMT（串聯(lián)質(zhì)譜標簽）

TMT是另一種同位素標記技術(shù)，用于相對定量。它通過相同質(zhì)量的標簽標記來自不同樣本的肽段。在MS/MS碎裂過程中，這些標簽釋放出dú tè的報告離子，使得可以基于離子強度進行定量。與iTRAQ類似，TMT提供準確且可重復的相對定量，適用于多個樣本的比較分析。

圖5. 10-plex TMT蛋白相對定量工作流程

TMT使得最多可以同時分析16至18個樣本（TMTpro），非常適合大規(guī)模的比較研究。它提供高精度和改進的數(shù)據(jù)一致性。然而，TMT試劑的成本和樣本處理的復雜性是潛在的限制因素。報告離子之間的干擾可能發(fā)生，尤其是在高度復雜的樣本中，這可能會影響定量準確性。

總結(jié)

定量蛋白質(zhì)組學已成為現(xiàn)代生命科學中bù kě huò quē的工具，支持基礎研究、臨床診斷和藥物開發(fā)的突破。無論是標記定量還是非標記定量策略，都有其dú tè的優(yōu)勢和挑戰(zhàn)，選擇合適的方法對于研究的準確性和效率至關(guān)重要。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，定量蛋白質(zhì)組學將在精準醫(yī)療和生物標志物發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮越來越重要的作用。

作為專注于蛋白質(zhì)組學領(lǐng)域的科研服務平臺，百泰派克生物科技將持續(xù)關(guān)注定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)的發(fā)展動態(tài)，結(jié)合先進平臺和專業(yè)團隊，為科研人員提供更高質(zhì)量的內(nèi)容解讀與實用服務，共同推動蛋白質(zhì)組學在生命科學中的創(chuàng)新與應用。

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