一、背景

小鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞分離自肝臟組織，是用混合酶灌流消化、反復(fù)低速離心、密度梯度離心法，并通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來(lái)。

肝臟是身體內(nèi)以代謝功能為主的一個(gè)器官，并在身體里面起著去氧化、儲(chǔ)存肝糖、分泌性蛋白質(zhì)的合成等作用；肝臟也制造消化系統(tǒng)中之膽汁。肝臟是機(jī)體內(nèi)臟里的器官，位于機(jī)體中的腹部位置，在右側(cè)橫隔膜之下，位于膽囊之前端且于右邊腎臟的前方，胃的上方。肝臟是機(jī)體消化系統(tǒng)中的消化腺，為一紅棕色的V字形器官。肝臟是尿素合成的主要器官，又是新陳代謝的重要器官。

肝臟在機(jī)體位置和形態(tài)結(jié)構(gòu)：肝臟位于右上腹，隱藏在右側(cè)膈下和肋骨深面，大部分肝為肋弓所復(fù)蓋，僅在腹上區(qū)、右肋弓間露出并直接接觸腹前壁，肝上面則與膈及腹前壁相接。肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(SEC)是肝臟內(nèi)所占比例的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，位于肝竇腔與肝細(xì)胞之間，具有物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、吞噬、抗原提呈、免疫耐受等功能。SEC由于擁有一般細(xì)胞所沒(méi)有的窗孔結(jié)構(gòu)、細(xì)胞間連結(jié)松散、內(nèi)皮下缺少基底膜而使其具有高度通透性，從而達(dá)到快速交換各種大小分子的目的。

肝在遭到多種病原侵襲時(shí)，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞窗孔逐漸減少或消失，內(nèi)皮下基膜形成，產(chǎn)生類似于連續(xù)型毛細(xì)血管的結(jié)構(gòu)，這一過(guò)程稱為肝竇毛細(xì)血管化。它由多種因素引起，其過(guò)程極復(fù)雜，在多種肝病的發(fā)病前期階段均有出現(xiàn)，近年來(lái)受到廣泛關(guān)注。

二、應(yīng)用

用于DLL4高表達(dá)促進(jìn)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞毛細(xì)血管化及肝纖維化進(jìn)展研究：

探討DLL4在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞毛細(xì)血管化中的作用,及其在肝纖維化發(fā)生、進(jìn)展中的角色。進(jìn)一步揭示肝纖維化的發(fā)病機(jī)制,為肝纖維化的治療提供新思路。

方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)及免疫熒光技術(shù)判斷HBV所致人肝硬化組織及CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化組織DLL4的表達(dá)及分布。利用免疫組織化學(xué)技術(shù)動(dòng)態(tài)觀察CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞毛細(xì)血管化的標(biāo)志分子CD31、v WF的表達(dá),應(yīng)用掃描電鏡動(dòng)態(tài)觀察肝竇內(nèi)皮細(xì)胞窗孔的變化,透射電鏡動(dòng)態(tài)觀察肝竇內(nèi)皮下細(xì)胞基底膜的形成。RT-PCR和Western blot檢測(cè)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞DLL4的表達(dá),Notch信號(hào)通路的激活情況及細(xì)胞基底膜組份Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原蛋白,層黏連蛋白,纖黏連蛋白的表達(dá)。

構(gòu)建DLL4過(guò)表達(dá)和敲減的人肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（TMNK-1）慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,RNA-sequence分析DLL4過(guò)表達(dá)引起肝竇內(nèi)皮細(xì)胞毛細(xì)血管化的機(jī)制。利用Transwell實(shí)驗(yàn)及人肝竇內(nèi)皮細(xì)胞與星狀細(xì)胞的共培養(yǎng)探索DLL4對(duì)肝內(nèi)血管阻力的影響。低氧培養(yǎng)明確低氧誘導(dǎo)因子-1α是否能誘導(dǎo)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞DLL4的表達(dá)。最后構(gòu)建針對(duì)小鼠DLL4的si RNA,通過(guò)尾靜脈注射觀察其對(duì)CCl4造模小鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞毛細(xì)血管化的緩解及肝纖維化的治療作用。

結(jié)果：DLL4在HBV相關(guān)人肝硬化組織及CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化組織中表達(dá)明顯升高,主要位于肝竇內(nèi)皮細(xì)胞。伴隨DLL4表達(dá)升高,CCl4誘導(dǎo)肝纖維化小鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞CD31、v WF的表達(dá)也明顯升高,窗孔逐漸減少,內(nèi)皮下細(xì)胞基底膜逐漸形成。與對(duì)照組相比,4w及6w CCl4小鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞DLL4、CD31v WF的表達(dá)升高,Notch信號(hào)通路激活,細(xì)胞基底膜組份I、III、IV型膠原蛋白,層黏連蛋白,纖黏連蛋白的表達(dá)升高。

GO及pathway分析證明DLL4可誘導(dǎo)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞分泌細(xì)胞基底膜組份蛋白。DLL4表達(dá)升高損害了肝竇內(nèi)皮細(xì)胞e NOS-s GC信號(hào),促進(jìn)endothelin-1的表達(dá),并且增加星狀細(xì)胞對(duì)肝竇內(nèi)細(xì)胞的覆蓋,最終導(dǎo)致肝竇阻力增高。在肝纖維化進(jìn)程中,低氧誘導(dǎo)因子-1α可誘導(dǎo)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞DLL4的表達(dá)。尾靜脈注射DLL4-si RNA可以緩解CCl4造模小鼠的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞毛細(xì)血管化與肝纖維化。

結(jié)論：DLL4介導(dǎo)的Notch信號(hào)可促進(jìn)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的毛細(xì)血管化。DLL4在肝纖維化肝臟血管病理性改建中發(fā)揮重要作用。

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