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細(xì)胞復(fù)蘇操作步驟與詳細(xì)方法指南|快速恢復(fù)細(xì)胞活性
細(xì)胞復(fù)蘇全過程：
細(xì)胞復(fù)蘇是將休眠的細(xì)胞重新活化，使之重新生長，進(jìn)入細(xì)胞周期，進(jìn)而分裂產(chǎn)生子細(xì)胞的過程。細(xì)胞復(fù)蘇后，可進(jìn)入細(xì)胞周期，重新獲得細(xì)胞類型特異的生物學(xué)功能。
一、 實驗前準(zhǔn)備
實驗開始前，將無菌培養(yǎng)瓶，15ml 離心管、移液管、移液槍、槍頭等放入無菌超凈工作臺，以紫外線照射 30min。然后，采用通風(fēng)機通風(fēng) 3min。以 75%酒精擦拭操作臺和雙手。
準(zhǔn)備好冰盒。
將離心機調(diào)節(jié)至 800rpm，5min。水浴箱調(diào)節(jié)至 37 度恒溫。取細(xì)胞培養(yǎng)基，放于水浴箱中預(yù)熱。
消毒雙手和超凈臺。取約 10ml 細(xì)胞培養(yǎng)基放于 15ml 離心管中。
實驗前備冰盒，快速由液氮中取出凍存的細(xì)胞，置于冰盒內(nèi)。然后迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱到 37 度的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化，注意管口處高于水面，以免進(jìn)入導(dǎo)致污染。整個解凍過程最好在 1 分鐘以內(nèi)，以防融化過程中產(chǎn)生大量冰晶損傷細(xì)胞，約 1min 后凍存管內(nèi)液體溶解，取出用酒精噴拭凍存管的外壁，立即拿入超凈臺內(nèi)。
二、制備細(xì)胞懸液
以無菌槍頭吸取細(xì)胞凍存液，置于已放入細(xì)胞培養(yǎng)基的離心管中，上下吹打 5 次，使凍存液與培養(yǎng)基充分混勻，盡量減少凍存液中 DMSO 的濃度，減輕細(xì)胞損傷。以封口膜封好管口。
配平離心：采用天平配平兩端，800rpm，室溫離心 5min。
三、細(xì)胞計數(shù)
采用細(xì)胞計數(shù)儀 快速細(xì)胞計數(shù)及活率分析儀進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。加入 10ml CASY-ton 至以標(biāo)記 viable 的管子中，加入 100ul 細(xì)胞懸液，顛倒混勻三次，可進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)?？梢娒亢辽龖乙褐杏谢罴?xì)胞 2 乘 10 的 5 次方.
四、細(xì)胞培養(yǎng)
離心后，吸棄上清液，不要吸到底部的細(xì)胞沉淀。根據(jù)計數(shù)結(jié)果，向離心管內(nèi)的細(xì)胞沉淀加入 10ml海星細(xì)胞培養(yǎng)基，反復(fù)吹打制成細(xì)胞懸液，吹打過程中盡量不要產(chǎn)生氣泡。符合細(xì)胞計數(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，左右輕輕搖動培養(yǎng)瓶，把細(xì)胞搖均勻，將NEST培養(yǎng)瓶放入 37℃，5％CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 2-4 小時或者 24-48 小時后換液繼續(xù)培養(yǎng)，換液的時間由細(xì)胞情況而定，一般以大部分細(xì)胞狀態(tài)良好時換液為宜，比如超過半數(shù)的細(xì)胞貼壁，
即可換液。
五、注意事項
1、取凍存管要做好保護措施
取細(xì)胞的過程中未帶好防凍手套，護目鏡。此項尤為重要，細(xì)胞凍存管可能漏入液氮，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，可導(dǎo)致爆炸,當(dāng)然，選擇好的凍存管此狀況一般不會發(fā)生。
2、解凍速度要快
在常溫下，凍存液中的 DMSO 對細(xì)胞的毒副作較大，因此，必須在一到兩分鐘內(nèi)使凍存液融化。如果復(fù)蘇溫度太慢，會造成細(xì)胞的損傷。
3、細(xì)胞貼壁少
一般凍存細(xì)胞解凍時 1ml 細(xì)胞液要加 10ml－15ml 培養(yǎng)液，培養(yǎng)基加入過多，造成細(xì)胞濃度過低，不利于細(xì)胞的貼壁，所以進(jìn)行細(xì)胞的計數(shù)尤為重要。
4、一次復(fù)蘇細(xì)胞不宜過多
細(xì)胞在解凍時，水浴鍋內(nèi)凍存管太多，導(dǎo)致傳熱不佳，使融化時間延長。正
規(guī)來說，需要迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化。并且一次復(fù)蘇細(xì)胞過多，容易忘記更換吸頭和吸管，導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。
更多防止細(xì)胞污染實驗室 儀器設(shè)備 > 干式細(xì)胞復(fù)蘇儀
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來源：蘇州阿爾法生物
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