RGC-32 deficiency protects endothelial cell from inflammation and attenuates atherosclerosis

Keywords: response gene to complement 32, atherosclerosis, endothelial cells, adhesion molecules, nuclear factor-κB

動(dòng)脈粥樣硬化作為心血管疾病的主要誘因，其病理進(jìn)程與內(nèi)皮細(xì)胞活化密切相關(guān)。活化的內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)表達(dá) ICAM-1、VCAM-1 等黏附分子，介導(dǎo)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮的相互作用，而 NF-κB 信號(hào)對(duì)黏附分子的轉(zhuǎn)錄起關(guān)鍵調(diào)控作用。

RGC-32 此前被發(fā)現(xiàn)參與細(xì)胞增殖、分化及癌癥等過(guò)程，且在高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖和肝脂肪變性中起促進(jìn)作用。最新研究顯示其在人動(dòng)脈粥樣硬化血管壁中表達(dá)并介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移，但其在動(dòng)脈粥樣硬化和內(nèi)皮炎癥中的功能性作用仍有待探究。

因此，喬治亞大學(xué)生理學(xué)與藥理學(xué)系和湖北醫(yī)科大學(xué)人民醫(yī)院內(nèi)分泌科的研究團(tuán)隊(duì)探索了RGC-32 介導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制。研究結(jié)果發(fā)表在Arterioscler Thromb Vasc Biol期刊題為“RGC-32 deficiency protects endothelial cell from inflammation and attenuates atherosclerosis”。

首先，為檢測(cè) RGC-32 在人類(lèi)正常血管和動(dòng)脈粥樣硬化病變中的表達(dá)，研究人員使用 RGC-32 抗體或正常兔 IgG（陰性對(duì)照）進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RGC-32 在人類(lèi)正常血管中無(wú)表達(dá)，但其在動(dòng)脈粥樣硬化病變的早期階段顯著誘導(dǎo)，并在晚期階段高度上調(diào)（圖 1A-1B）。在 ApoE?/?小鼠模型中，高脂飲食可誘導(dǎo)主動(dòng)脈根部 RGC-32 表達(dá)（圖 1C-1D），且其定位集中于血管內(nèi)層。共免疫染色進(jìn)一步顯示，RGC-32 與內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物 CD31 共定位（圖 1E），而與平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物 α-SMA 無(wú)共定位，表明 RGC-32 主要表達(dá)于動(dòng)脈粥樣硬化病變的內(nèi)皮細(xì)胞中。

圖 1    動(dòng)脈粥樣硬化病變的內(nèi)皮細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá) RGC-32。

為了探究 RGC-32 在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用，研究人員構(gòu)建了 ApoE?/?Rgc32?/?雙敲除小鼠模型。高脂飲食 12 周及普通飼料喂養(yǎng) 1 年的結(jié)果顯示，ApoE?/?Rgc32?/?小鼠中觀察到的動(dòng)脈粥樣硬化病變面積顯著小于 ApoE?/?小鼠（ 2A-2D）。Rgc32?/?還減少了喂食普通飼料的一歲 ApoE?/?小鼠中自發(fā)形成的動(dòng)脈粥樣硬化病變的大?。▓D 2E-2H）。進(jìn)一步分析顯示，RGC-32 缺失并未引起血清脂蛋白組分、甘油三酯水平及體重的顯著變化，肝組織脂質(zhì)沉積和脂肪變性程度也與對(duì)照組無(wú)差異。這說(shuō)明 RGC-32 并非通過(guò)影響血脂代謝或肝脂肪變來(lái)調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化，其抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用可能源于其他機(jī)制。

圖 2    RGC-32 缺失減輕了 ApoE?/? 小鼠中飲食誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化。

然后，為了進(jìn)一步了解 ApoE?/?和 ApoE?/?Rgc32?/?小鼠之間動(dòng)脈粥樣硬化的差異，研究人員分析了動(dòng)脈粥樣硬化病變的細(xì)胞組成。發(fā)現(xiàn) RGC-32 缺失并未影響病變中膠原和平滑肌細(xì)胞的含量及纖維帽厚度，但顯著降低了巨噬細(xì)胞在病變中的浸潤(rùn)程度（圖 3A-3B）。進(jìn)一步通過(guò)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物 CD68 與增殖標(biāo)志物 Ki67 的共免疫熒光染色證實(shí)，RGC-32 缺失不影響病變內(nèi)巨噬細(xì)胞的增殖（圖 3C-3D），表明其導(dǎo)致巨噬細(xì)胞減少的原因可能是抑制了單核細(xì)胞的黏附和浸潤(rùn)過(guò)程。

圖 3    RGC-32 缺失抑制了動(dòng)脈粥樣硬化病變中的巨噬細(xì)胞含量。

為了明確駐留血管細(xì)胞（如內(nèi)皮細(xì)胞）中的 RGC-32 是否促成進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。研究人員通過(guò)骨髓移植實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了 RGC-32 缺失的駐留血管細(xì)胞（內(nèi)皮細(xì)胞等）與正常巨噬細(xì)胞的嵌合模型。結(jié)果顯示，當(dāng) Rgc32?/?受體小鼠接受 WT 骨髓移植后，其動(dòng)脈粥樣硬化病變面積和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)程度仍顯著低于 WT 受體小鼠（圖 4A-4F）。且血清脂質(zhì)水平、肝脂肪變性無(wú)差異。這表明巨噬細(xì)胞來(lái)源的 RGC-32 不影響病變發(fā)展，而駐留血管細(xì)胞（主要是內(nèi)皮細(xì)胞）中的 RGC-32 才是促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵因素。

圖4    駐留血管細(xì)胞中的RGC-32對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展至關(guān)重要。

為了探究 Rgc32?/?減輕巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的機(jī)制，研究人員培養(yǎng)了來(lái)自 WT 和 Rgc32?/?小鼠的原代主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，并檢測(cè)黏附分子的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RGC-32 缺失在體外可顯著抑制原代主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中 ICAM-1 和 VCAM-1 的表達(dá)，但對(duì) P - 選擇素?zé)o影響（圖 5A-5B）。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，ApoE?/?Rgc32?/?小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變處的內(nèi)皮細(xì)胞 ICAM-1、VCAM-1 表達(dá)量也明顯低于對(duì)照組 （圖 5C-5D ）。此外，RGC-32 缺失對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的黏附分子表達(dá)無(wú)顯著作用。這表明RGC-32 主要調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞 ICAM-1 和 VCAM-1 的表達(dá)，介導(dǎo)單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附過(guò)程。

圖5    RGC-32對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1和VCAM-1表達(dá)及單核細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞相互作用至關(guān)重要。

接下來(lái)，研究人員探究了 RGC-32 是否介導(dǎo) TNF-α 誘導(dǎo)的內(nèi)皮 ICAM-1 和 VCAM-1 表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲低 RGC-32 會(huì)減弱 TNF-α 誘導(dǎo)的啟動(dòng)子活性，而 RGC-32 過(guò)表達(dá)則增強(qiáng)該活性（圖 5E），表明 RGC-32 在 TNF-α 誘導(dǎo)的內(nèi)皮 ICAM-1 和 VCAM-1 轉(zhuǎn)錄中起關(guān)鍵作用。 在體外實(shí)驗(yàn)中，敲低 RGC-32 可顯著抑制 TNF-α 誘導(dǎo)的 HUVECs 中 ICAM-1 和 VCAM-1 啟動(dòng)子活性及蛋白表達(dá)（圖 5F-5G）。為了評(píng)估 RGC-32 對(duì) ICAM-1 和 VCAM-1 表達(dá)的功能意義，研究人員將原代小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞用載體或 TNF-α 處理 24 小時(shí)，然后與 Calcein AM 標(biāo)記的 THP-1 細(xì)胞共孵育，從而研究 RGC-32 是否影響單核細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用。結(jié)果顯示，RGC-32 缺失削弱了 TNF-α 刺激下 THP-1 單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附（圖5H-5I），反之 RGC-32 過(guò)表達(dá)則促進(jìn)兩者結(jié)合（圖5J-5K）。這些結(jié)果表明，RGC-32 介導(dǎo) TNF-α 誘導(dǎo)的內(nèi)皮 ICAM-1 和 VCAM-1 表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)單核細(xì)胞 - 內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用。

最后，為了驗(yàn)證RGC-32 可能通過(guò)調(diào)控 NF-κB 信號(hào)通路調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞 ICAM-1 和 VCAM-1 的表達(dá)這一假設(shè)。研究人員使用吡咯烷二硫代氨基甲酸銨（PDTC）在表達(dá) RGC-32 的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中阻斷 NF-κB 信號(hào)。體外實(shí)驗(yàn)表明，RGC-32 過(guò)表達(dá)可激活 NF-κB 磷酸化，誘導(dǎo) ICAM-1 和 VCAM-1 表達(dá)，而 NF-κB 抑制劑 PDTC 可阻斷這一過(guò)程（圖 6A-6B）；反之，敲低 RGC-32 則抑制 TNF-α 誘導(dǎo)的 NF-κB 核轉(zhuǎn)位。免疫共沉淀證實(shí) RGC-32 與 NF-κB 存在物理相互作用，且 TNF-α 可增強(qiáng)兩者結(jié)合（圖 6C-6D）。染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示，敲低 RGC-32 減少了 TNF-α 誘導(dǎo)的 NF-κB 與 ICAM-1 和 VCAM-1 啟動(dòng)子的結(jié)合，而過(guò)表達(dá) RGC-32 則增加了這種結(jié)合（圖 6E-6F）。TNF-α 誘導(dǎo)了 RGC-32 的核轉(zhuǎn)位，使用 RGC-32 抗體的染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)顯示，TNF-α 增加了 RGC-32 與 ICAM-1 和 VCAM-1 啟動(dòng)子的結(jié)合（圖 6G-6H）。這些結(jié)果表明，RGC-32 直接與 NF-κB 結(jié)合并促進(jìn)其與 ICAM-1 和 VCAM-1 啟動(dòng)子的結(jié)合，從而在動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中促進(jìn)它們的表達(dá)。

圖6    RGC-32通過(guò)NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)。

總之，研究表明，RGC-32 通過(guò)促進(jìn)單核細(xì)胞-EC 相互作用介導(dǎo)雄性動(dòng)物模型中的動(dòng)脈粥樣硬化生成，這是由于誘導(dǎo)內(nèi)皮 ICAM-1 和 VCAM-1 表達(dá)，至少部分地通過(guò) NF-κB 信號(hào)通路。ECs 中的選擇性誘導(dǎo)及其促進(jìn)單核細(xì)胞-EC 相互作用的作用使 RGC-32 成為動(dòng)脈粥樣硬化的新型潛在治療靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：Cui XB, Luan JN, Dong K, Chen S, Wang Y, Watford WT, Chen SY. RGC-32 (Response Gene to Complement 32) Deficiency Protects Endothelial Cells From Inflammation and Attenuates Atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2018 Apr;38(4):e36-e47. doi: 10.1161/ATVBAHA.117.310656. Epub 2018 Feb 15. PMID: 29449334; PMCID: PMC5864544.

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