一、ELISA技術(shù)概述

酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）是一種基于抗原抗體特異性反應(yīng)的固相免疫檢測技術(shù)，廣泛應(yīng)用于體液中微量物質(zhì)的檢測。它起源于20世紀70年代初，由多位學者共同推動發(fā)展，如今已成為分析化學和生物醫(yī)學研究中的重要工具。

二、ELISA的核心原理

ELISA的基本原理是利用抗原與抗體之間的特異性結(jié)合，將待測物與酶連接，再通過酶催化底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，從而實現(xiàn)定量或定性分析。這一過程涉及抗原或抗體的固相化，以及抗原或抗體的酶標記。在檢測過程中，受檢標本與固相載體上的抗原或抗體發(fā)生反應(yīng)，經(jīng)過洗滌分離后，加入酶標記的抗原或抗體進一步結(jié)合。最終，通過酶與底物反應(yīng)生成的有色產(chǎn)物的顏色深淺，反映標本中待測物質(zhì)的含量。

三、ELISA的主要類型及操作流程

（一）雙抗體夾心法

檢測抗原：首先將特異性抗體固定在固相載體上，加入待測標本，使標本中的抗原與固相抗體結(jié)合。隨后加入酶標記的抗體，與固相抗原抗體復(fù)合物結(jié)合。最后加入底物顯色，通過比色分析確定抗原含量。此法適用于檢測大分子抗原，如HBeAg、HBsAg等。

檢測抗體：類似檢測抗原的操作，但使用特異性抗原包被和制備酶結(jié)合物，用于檢測相應(yīng)抗體。

（二）間接法

主要用于檢測抗體。將抗原固定在固相載體上，加入受檢血清，使血清中的特異性抗體與抗原結(jié)合。再加入酶標記的抗抗體，與固相抗體結(jié)合。此法適用于傳染病抗體檢測，關(guān)鍵在于抗原的純度。

（三）競爭法

檢測抗體：標本中的抗體與酶標抗體競爭結(jié)合固相抗原，標本中抗體越多，結(jié)合的酶標抗體越少，顯色越淺。

檢測抗原：適用于小分子抗原或半抗原的檢測，標本中抗原與酶標抗原競爭結(jié)合固相抗體。

（四）捕獲法

用于檢測IgM抗體，常用于傳染病早期診斷。先用抗人IgM抗體捕獲血清中的IgM，再加入特異性抗原和酶標抗體進行檢測。

（五）親和素-生物素系統(tǒng)ELISA

利用親和素與生物素的高親和力，提高檢測的靈敏度和特異性。分為LAB法和ABC法，通過生物素標記抗體或抗原，結(jié)合親和素和酶標生物素進行檢測。

四、ELISA的特點

高靈敏度：酶的催化作用放大了免疫反應(yīng)信號，可實現(xiàn)微量物質(zhì)的檢測。

強特異性：基于抗原抗體的高度特異性結(jié)合，確保檢測的準確性。

五、ELISA實驗材料與儀器

聚苯乙烯微量培養(yǎng)板

酶聯(lián)免疫檢測儀

辣根過氧化物酶標記抗體

包被液、稀釋液、洗滌液、封閉液

底物溶液（如鄰苯二胺）和終止液

六、ELISA操作步驟及要點

（一）操作步驟

包被抗原：將抗原稀釋后加入培養(yǎng)板孔中，37℃溫育1小時，4℃過夜。

洗滌：用洗滌液清洗培養(yǎng)板，去除未結(jié)合物質(zhì)。

封閉：加入封閉液，37℃孵育1小時，防止非特異性結(jié)合。

加入標本：加入稀釋后的待測血清，37℃孵育2小時。

加入酶標抗體：加入辣根過氧化物酶標記的抗體，37℃孵育1小時。

顯色：加入底物溶液，室溫避光反應(yīng)10-15分鐘。

終止反應(yīng)：加入終止液，終止顯色反應(yīng)。

結(jié)果讀?。河妹嘎?lián)免疫檢測儀在490nm波長讀取吸光值。

（二）操作要點

標本處理：血清標本應(yīng)避免溶血和細菌污染，可短時間4℃保存或低溫冰存。反復(fù)凍融會影響抗體效價，需分裝保存。

試劑準備：嚴格按試劑盒說明準備試劑，使用高質(zhì)量的蒸餾水或去離子水。

加樣：避免氣泡和交叉污染，確保加樣準確。

溫育：37℃溫育1-2小時，確保抗原抗體充分反應(yīng)。

洗滌：洗滌是關(guān)鍵，可采用浸泡式或流水沖洗式，確保去除未結(jié)合物質(zhì)。

顯色與比色：顯色時間需嚴格控制，比色時需校準儀器，選擇合適波長。

七、結(jié)果判斷

定性檢測：通過目視或比色法判斷陽性或陰性?？刹捎藐栃耘卸ㄖ捣ɑ驑吮?陰性對照比值法。

定量檢測：通過標準曲線法，根據(jù)吸光值確定標本中待測物質(zhì)的濃度。

ELISA技術(shù)因其操作簡便、靈敏度高、特異性強，已成為生物醫(yī)學研究和臨床診斷中的工具。掌握其原理和操作要點，可有效提高檢測的準確性和可靠性。

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