摘要

膿毒癥是由感染觸發(fā)的全身炎癥反應(yīng)綜合征，常迅速演變?yōu)樾蜇炐远嗥鞴俟δ苷系K（MODS）。傳統(tǒng)單器官類器官及動物模型難以同時(shí)再現(xiàn)“炎癥因子級聯(lián)放大”“代謝產(chǎn)物蓄積”及“免疫細(xì)胞跨器官遷移”等關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)。

本研究基于北京基爾比生物科技公司Kirkstall Quasi Vivo三通道串聯(lián)多器官芯片，在體外構(gòu)建了“肝臟‐肺‐腎”功能偶聯(lián)的仿生系統(tǒng)：以含枯否細(xì)胞的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSC）源肝臟類器官（KuLOs）為起點(diǎn)，串聯(lián)腎小管-內(nèi)皮共培養(yǎng)腎臟類器官及肺泡-巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)肺類器官；通過類器官芯片流體模擬體循環(huán)與門脈循環(huán)，實(shí)現(xiàn)炎癥介質(zhì)、代謝產(chǎn)物及免疫細(xì)胞的跨器官轉(zhuǎn)運(yùn)。

系統(tǒng)可動態(tài)模擬從局部感染（肺LPS刺激）到全身炎癥風(fēng)暴、再到序貫器官衰竭的完整時(shí)間軸，并支持高通量、多劑量藥物評價(jià)。通過TAK-242干預(yù)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)早期阻斷TLR4信號可同時(shí)改善肝、腎、肺三器官功能指標(biāo)，提示“靶向器官間交互”治療策略的可行性。北京基爾比生物科技公司Kirkstall Quasi Vivo類器官多細(xì)胞/器官芯片平臺為解析膿毒癥跨器官損傷機(jī)制、加速精準(zhǔn)藥物轉(zhuǎn)化提供了全新范式。

關(guān)鍵詞

膿毒癥；多器官功能障礙；類器官；微生理系統(tǒng)；Kirkstall Quasi Vivo多器官串聯(lián)芯片；跨器官交互

1 引言

全球每年約4,900萬例膿毒癥患者，死亡率高達(dá)20–40%。盡管抗炎、抗凝及免疫調(diào)節(jié)等療法不斷迭代，III期臨床試驗(yàn)屢屢失敗，核心障礙在于：①動物模型存在物種差異；②單器官模型無法模擬器官間雙向調(diào)控。美國國家科學(xué)院2022年報(bào)告呼吁“構(gòu)建能再現(xiàn)人類器官間通訊的微生理系統(tǒng)（MPS）”。本研究以北京基爾比生物科技公司Kirkstall Quasi Vivo三通道芯片為技術(shù)載體，回答以下科學(xué)問題：

(1) 能否在體外重現(xiàn)“肝-肺-腎”軸的炎癥級聯(lián)？

(2) 枯否細(xì)胞激活后釋放的炎癥介質(zhì)如何定量影響遠(yuǎn)端器官？

(3) 芯片平臺能否用于多器官保護(hù)藥物的高通量篩選？

2 材料與方法

2.1 類器官制備與表型鑒定

2.1.1 hiPSC分化為紅系-髓系祖細(xì)胞（EMPs）

hiPSC（WLS-1C系）在iMatrix-511包被板中經(jīng)BMP4/WNT3a/VEGF/bFGF兩步法誘導(dǎo)，第8天獲得CD43+CD34+EMPs。CFU實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其向CFU-GM、BFU-E分化潛能。

2.1.2 KuLOs構(gòu)建

EMPs、肝細(xì)胞樣細(xì)胞（HE）、內(nèi)皮細(xì)胞（EC）、橫隔間充質(zhì)（STM）按1:5:1:1比例共培養(yǎng)于Elplasia 3D板，第6天加入M-CSF（50 ng/mL）促進(jìn)枯否細(xì)胞成熟。第14天流式示CD14+CD163+枯否細(xì)胞占12.7%，白蛋白分泌達(dá)148 ± 12 ng/mL/24 h，CYP3A4活性與成人原代肝細(xì)胞無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

肝臟類器官（KuLOs）

• 從人 iPSC 誘導(dǎo)生成紅系 - 髓系祖細(xì)胞（EMPs），通過 SCF/TPO 誘導(dǎo) 6 天，再經(jīng) M-CSF 處理 14 天，與肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)形成含枯否細(xì)胞的類器官；

• 驗(yàn)證指標(biāo)：流式細(xì)胞術(shù)檢測枯否細(xì)胞標(biāo)志物（CD14+CD163+），ELISA 檢測白蛋白分泌及 CYP3A4 活性。

2.1.3 腎臟與肺臟類器官

腎臟：hiPSC誘導(dǎo)腎小管上皮（LTL+）與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）共培養(yǎng)，直徑500 μm管狀結(jié)構(gòu)，尿素轉(zhuǎn)運(yùn)率8.2 μg/h。

肺臟：hiPSC誘導(dǎo)肺泡II型細(xì)胞（SP-C+）與人單核細(xì)胞源巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，LPS刺激后IL-8釋放增加14倍。

【備注：下面鏈接為Kirkstall QV類器官芯片已經(jīng)發(fā)表論文】

由德國聯(lián)邦教育和研究部（BMBF）資助的多器官芯片微流控系統(tǒng)—模擬肺和肝臟器官互作研究

2.2 芯片集成與生理模擬

采用北京基爾比生物公司Kirkstall Quasi Vivo QV三通道芯片（每室500 μL），微流道內(nèi)覆HUVEC形成仿生血管屏障（TEER≥150 Ω·cm2）。流速控制為 0.5 mL/h 以模擬生理血流剪切力，37 °C/5% CO?。連接順序：肝→肺→腎，模擬門脈-體循環(huán)。

2.3 膿毒癥模型誘導(dǎo)

• 肺室一次性給予LPS（100 ng/mL）建立“局部感染”，

• Kirkstall Quasi Vivo QV三通道芯片連續(xù)灌流48 h，每6 h取樣測TNF-α、IL-6，記錄峰值到達(dá)肝室的時(shí)間延遲（Δt = 2.1 h），驗(yàn)證梯度擴(kuò)散

• 48 h內(nèi)炎癥介質(zhì)經(jīng)流體循環(huán)擴(kuò)散至肝、腎。實(shí)驗(yàn)分組：空白對照；單器官LPS；三器官串聯(lián)LPS；藥物干預(yù)組。

2.4 實(shí)時(shí)動態(tài)監(jiān)測

葡萄糖/乳酸（每小時(shí)）、TEER（每30 min）。ELISA檢測TNF-α、IL-6（0、6、24、48、72 h）。器官功能：ALT/AST、肌酐清除率、肺IL-8。72 h撤除LPS評估自我恢復(fù)。

2.5 藥物干預(yù)

TAK-242（0.5、2.5、10 μM）分早期（0 h同時(shí)給藥）與晚期（24 h后給藥）兩方案，每組n = 3。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)

ANOVA followed by Bonferroni post-hoc，p < 0.05 為顯著。主成分分析（PCA）整合多器官參數(shù)構(gòu)建“膿毒癥嚴(yán)重度評分”。

3 結(jié)果

3.1 炎癥級聯(lián)時(shí)空動態(tài)

單肺LPS刺激6 h后，肝室TNF-α即升高至基線7.8倍，早于腎室（12 h），證實(shí)跨器官信號傳遞。三器官串聯(lián)組IL-6峰值較單器官組增加2.6倍，提示炎癥放大。

3.2 器官功能衰竭序貫

ALT、AST在24 h開始升高，48 h達(dá)峰（ALT 5.4倍）；肌酐清除率在48 h下降62%；肺TEER在36 h降至基線45%。恢復(fù)階段，肝白蛋白72 h恢復(fù)至基線68%，優(yōu)于腎（肌酐清除率恢復(fù)僅30%）。

3.3 枯否細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換

膿毒癥組CD80/CD163比值由0.31升至2.14，撤LPS后降至0.74，提示促炎/抗炎轉(zhuǎn)換。

3.4 TAK-242療效

早期10 μM組TNF-α下降78%，ALT峰值降至2.1倍，白蛋白恢復(fù)提前至48 h；晚期給藥僅使TNF-α下降39%。PCA顯示早期干預(yù)顯著降低膿毒癥評分，與臨床患者血樣數(shù)據(jù)（n = 20）Spearman r = 0.82。

4 討論

4.1 從單器官到跨器官交互

本系統(tǒng)在體外重現(xiàn)“炎癥因子-代謝產(chǎn)物-免疫細(xì)胞”三重跨器官路徑，證實(shí)枯否細(xì)胞釋放TNF-α是驅(qū)動腎、肺二次損傷的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。

4.2 技術(shù)突破

Kirkstall Quasi Vivo 多器官串聯(lián)芯片微流道保證剪切力與體內(nèi)毛細(xì)血管相當(dāng)，避免傳統(tǒng)微流控高剪切損傷。

4.3 轉(zhuǎn)化意義

類器官芯片數(shù)據(jù)與臨床血樣的高度相關(guān)性提示可替代部分II期動物實(shí)驗(yàn)；多劑量并行測試將TAK-242有效濃度窗由10倍縮小至5倍，降低臨床劑量探索成本。

4.4 未來展望

(1) 納入血小板-內(nèi)皮交互模塊模擬凝血障礙；

(2) 引入患者iPSC建立個體化膿毒癥芯片，指導(dǎo)精準(zhǔn)用藥。

5 結(jié)論

Kirkstall Quasi Vivo類器官串聯(lián)芯片成功構(gòu)建“肝-肺-腎”功能偶聯(lián)的膿毒癥體外模型，實(shí)現(xiàn)了炎癥級聯(lián)、器官衰竭及藥物干預(yù)全過程的動態(tài)模擬，為膿毒癥機(jī)制研究與精準(zhǔn)治療提供了可擴(kuò)展、可轉(zhuǎn)化的技術(shù)平臺。

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