在細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，永生化人肺成纖維細(xì)胞系是一種具研究價值和應(yīng)用潛力的細(xì)胞模型。而掌握其正確的操作使用方法，對于細(xì)胞的培養(yǎng)、實驗設(shè)計以及結(jié)果解讀都有著至關(guān)重要的意義。

細(xì)胞培養(yǎng)前的準(zhǔn)備

在進(jìn)行永生化人肺成纖維細(xì)胞系的培養(yǎng)之前，充分的準(zhǔn)備工作是確保實驗順利進(jìn)行的關(guān)鍵。首先，需要選擇合適的培養(yǎng)基。目前，常見的培養(yǎng)基包括 DMEM 和 RPMI 1640，這兩種培養(yǎng)基都能為細(xì)胞提供必要的營養(yǎng)物質(zhì)。經(jīng)實驗驗證，含有 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基在支持永生化人肺成纖維細(xì)胞系的生長方面表現(xiàn)出色。胎牛血清富含多種生長因子和激素，能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長和繁殖。

其次，培養(yǎng)環(huán)境的準(zhǔn)備同樣重要。細(xì)胞培養(yǎng)需要在無菌的環(huán)境下進(jìn)行，因此培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶需要經(jīng)過嚴(yán)格的滅菌處理?？梢允褂酶邏簻缇佭M(jìn)行物理滅菌，或者使用紫外線照射的方式對細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行消毒。培養(yǎng)箱的參數(shù)設(shè)置也至關(guān)重要，溫度應(yīng)保持在 37℃，CO?濃度維持在 5% 左右，這樣的環(huán)境條件能夠模擬細(xì)胞在體內(nèi)的生理環(huán)境，有利于細(xì)胞的正常生長和代謝。

細(xì)胞的復(fù)蘇操作

細(xì)胞復(fù)蘇是將凍存的細(xì)胞恢復(fù)到正常生長狀態(tài)的關(guān)鍵步驟。正確的復(fù)蘇操作可以有效提高細(xì)胞的存活率和后續(xù)的生長性能。復(fù)蘇過程中，快速解凍是關(guān)鍵。將凍存的細(xì)胞從液氮中取出后，應(yīng)迅速置于 37℃水浴中，輕輕搖晃使其快速解凍。解凍后的細(xì)胞應(yīng)立即用培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，以降低凍存液中保護(hù)劑對細(xì)胞的毒性。

接下來，將細(xì)胞懸液輕輕吹打混勻后，加入適量的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中。在轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶的過程中，動作要輕柔，避免劇烈震蕩對細(xì)胞造成損傷。然后將培養(yǎng)瓶置于預(yù)先設(shè)置好的培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)。在培養(yǎng)的初期，細(xì)胞需要一個適應(yīng)環(huán)境的過程，因此在最初的 24 小時內(nèi)盡量減少對細(xì)胞的干擾，避免頻繁開箱觀察或移動培養(yǎng)瓶。

細(xì)胞培養(yǎng)過程中的注意事項

在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，定期更換培養(yǎng)基是維持細(xì)胞良好生長狀態(tài)的重要措施。一般來說，每 2 - 3 天需要更換一次培養(yǎng)基，以確保細(xì)胞能夠獲得充足的營養(yǎng)物質(zhì)，并及時排出代謝廢物。換液操作需要在無菌環(huán)境下進(jìn)行，避免外界微生物的污染。同時，要注意觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，如細(xì)胞的形態(tài)、顏色以及是否有雜質(zhì)等。

此外，細(xì)胞的傳代操作也是細(xì)胞培養(yǎng)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。當(dāng)細(xì)胞生長到一定密度時，需要進(jìn)行傳代，以防止細(xì)胞因過度擁擠而出現(xiàn)生長抑制或接觸抑制現(xiàn)象。傳代時，使用合適的胰酶濃度和消化時間至關(guān)重要。胰酶濃度過高或消化時間過長會導(dǎo)致細(xì)胞表面蛋白受損，影響細(xì)胞的貼壁和生長；而胰酶濃度過低或消化時間過短則無法使細(xì)胞全脫離培養(yǎng)瓶壁，影響傳代效果。通常，0.25% 的胰酶消化液在 37℃下消化 1 - 2 分鐘即可使細(xì)胞順利脫落。在傳代過程中，要盡量保持細(xì)胞的完整性，避免過度吹打?qū)е录?xì)胞破損。

細(xì)胞凍存的要點(diǎn)

細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的重要手段，正確的凍存操作可以確保細(xì)胞在長時間保存后仍能保持良好的活性和生物學(xué)特性。凍存液的配制是凍存成功的關(guān)鍵因素之一。常用的凍存液由 10% 甘油、10% DMSO 和 80% 胎牛血清混合而成。甘油和 DMSO 能夠有效降低細(xì)胞內(nèi)水分的冰點(diǎn)，減少冰晶的形成對細(xì)胞造成的損傷；胎牛血清則為細(xì)胞提供了營養(yǎng)和保護(hù)作用。

在凍存過程中，細(xì)胞的濃度也需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。一般來說，細(xì)胞濃度應(yīng)控制在 1×10? - 5×10? cells/ml 范圍內(nèi)。濃度過高會導(dǎo)致細(xì)胞在凍存過程中因代謝廢物積累而受到毒害；濃度過低則可能使細(xì)胞在復(fù)蘇后難以形成足夠的細(xì)胞群，影響細(xì)胞的生長和繁殖。將調(diào)整好濃度的細(xì)胞懸液分裝到凍存管中，每管體積一般不超過 1 ml，以確保細(xì)胞能夠均勻受冷。

細(xì)胞計數(shù)與活力檢測

在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，定期進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)和活力檢測是了解細(xì)胞生長狀態(tài)和健康程度的重要手段。細(xì)胞計數(shù)常用的工具是血細(xì)胞計數(shù)板。在使用血細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)時，需要注意將細(xì)胞懸液充分混勻，避免細(xì)胞沉淀或聚集，以確保計數(shù)的準(zhǔn)確性。同時，計數(shù)時要按照正確的網(wǎng)格區(qū)域進(jìn)行統(tǒng)計，避免重復(fù)計數(shù)或遺漏。

細(xì)胞活力檢測方面，臺盼藍(lán)排斥法是一種簡單而有效的方法。臺盼藍(lán)能夠進(jìn)入死細(xì)胞的細(xì)胞膜，使其染成藍(lán)色，而活細(xì)胞的細(xì)胞膜具有選擇通透性，能夠排斥臺盼藍(lán)，保持無色。通過顯微鏡觀察計數(shù)，可以快速區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞，并計算細(xì)胞的存活率。此外，MTT 法也是一種常用的細(xì)胞活力檢測方法。MTT 能夠被活細(xì)胞內(nèi)的線粒體還原酶還原為藍(lán)色的結(jié)晶產(chǎn)物，通過比色法測定吸光度值，可以間接反映細(xì)胞的代謝活性和數(shù)量。