重組人IL2原核表達(dá)載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

來源：賽爾瑞成（北京）生命科學(xué)技術(shù)有限公司 2025年08月12日 11:42

　　重組人IL2通過原核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)是一種高效且廣泛應(yīng)用的技術(shù)路線，但其過程需要克服多種技術(shù)挑戰(zhàn)以確保產(chǎn)品的活性、純度和安全性。以下是從基因克隆到最終制劑的關(guān)鍵步驟詳解：

　　一、重組人IL2原核表達(dá)載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

　　1.分子設(shè)計要點(diǎn)

　　密碼子優(yōu)化

　　由于大腸桿菌偏好特定密碼子用法，需對人IL-2成熟肽編碼序列進(jìn)行同義突變改造，避免稀有密碼子導(dǎo)致的翻譯停滯。例如將人類基因中的AGA/AGG替換為E.coli高頻使用的GCG等。

　　融合標(biāo)簽選擇

　　常用His-tag（6×組氨酸）、GST或MBP標(biāo)簽便于親和層析純化，但需注意標(biāo)簽位置不影響N端信號肽切割及生物活性。部分研究采用SUMO融合提高可溶性表達(dá)。

　　啟動子強(qiáng)度調(diào)控

　　使用T7強(qiáng)啟動子配合Lac阻遏系統(tǒng)實現(xiàn)誘導(dǎo)控制，防止基礎(chǔ)表達(dá)過高導(dǎo)致包涵體過早形成。建議設(shè)置梯度IPTG濃度實驗確定最佳誘導(dǎo)時機(jī)。

　　2.轉(zhuǎn)化效率提升策略

　　采用電穿孔法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化率可達(dá)107CFU/μgDNA以上。通過抗生素平板篩選單克隆后，進(jìn)行菌落PCR驗證插入片段完整性。

　　二、重組人IL2包涵體變性復(fù)性工程：

　　1.洗滌純化流程

　　選擇性提取

　　使用含2M尿素的緩沖液反復(fù)洗滌沉淀，去除膜碎片、核酸等雜質(zhì)，此時大部分雜蛋白已被溶解剔除。

　　變性處理

　　在8M尿素+10mMDTT中完*解聚蛋白質(zhì)二硫鍵，離心去除不溶物質(zhì)后獲得澄清裂解物。

　　梯度透析復(fù)性

　　采用階梯式尿素濃度遞減方案（8M→6M→4M→2M→0M），每步間隔4小時，配合緩慢攪拌促進(jìn)正確折疊。添加0.5ML-精氨酸作為分子伴侶增強(qiáng)復(fù)性效率。

　　2.色譜精細(xì)純化

　　離子交換層析（IEX）：利用HETP特性分離電荷異質(zhì)性組分，陽離子交換柱收集目標(biāo)峰；

　　疏水相互作用色譜（HIC）：去除殘留的疏水性聚集體；

　　尺寸排阻色譜（SEC）：最后拋光步驟確保單體純度＞98%，去除多聚體及碎片。

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