一、背景

支原體染色檢測試劑盒是利用熒光染料（bisbenzimide,Hoechst 33258）檢測支原體污染。這種染料會結合到DNA的A-T富集區(qū)域，因為支原體的DNA中A-T含量高（55％～80％），所以可將其染色而被檢測到。被支原體污染的細胞經染色后在細胞周圍可看到許多大小均一的熒光小點，即為支原體的DNA染色斑，說明有支原體污染。Hoechst 33258的激發(fā)波長為346nm，發(fā)射波長為460nm；Hoechst 33258和雙鏈DNA結合后，激發(fā)波長為352nm，發(fā)射波長為461nm。

二、支原體染色檢測試劑盒操作步驟

貼壁細胞：

1、被檢細胞接種于無菌的6孔細胞培養(yǎng)板中，接種密度為1-2×104。同時，接種正常無支原體感染的同種細胞，作為陰性對照。

2、5天后，先吸去培養(yǎng)液，再加入1ml的固定液，靜置20min，

3、吸去固定液，晾干。

4、于每孔中，加入1ml的Hoechst33258工作液（Hoechst 33258工作液須覆蓋全部被檢細胞），37℃避光放置15-20min或室溫靜置20～30min。

5、吸去Hoechst 33258工作液，加入2ml滅菌超純水洗滌三次，直接風干。風干后加入一滴封片液，并以蓋玻片覆蓋。

6、熒光顯微鏡觀察。用紫外激發(fā)光激發(fā)，觀察細胞周圍是否有藍色熒光小點或串珠狀熒光小點。

懸浮細胞：

1、收集需檢測的細胞，1500rpm，5min。

2、將收集的細胞涂片于載玻片上，再加1ml的固定液，靜置20min。

3、吸去固定液，晾干。

4、于每孔中，加入1ml的Hoechst33258工作液（Hoechst 33258工作液須覆蓋全部被檢細胞），37℃避光放置15～20min或室溫靜置20～30min。

5、吸去Hoechst 33258工作液，用無菌水洗滌玻片3次，直接風干。風干后加入一滴封固液，并以蓋玻片覆蓋。

6、熒光顯微鏡觀察。用紫外激發(fā)光激發(fā)，觀察細胞周圍是否有藍色熒光小點或串珠狀熒光小點。

支原體染色檢測試劑盒結果判斷：

陰性：僅見細胞的細胞核呈現黃綠色熒光。

陽性：除細胞外，細胞周圍可見大量的大小均一的熒光著色顆粒。

三、應用

支原體染色檢測試劑盒可以用于細胞庫支原體檢測體系以及支原體去除方法的建立：

生命科學迎來了繁榮發(fā)展的時代。從生物石油到藥品、醫(yī)療,無一不和生命科學息息相關。細胞株作為生命科學研究的重要材料顯得尤為重要。無污染的細胞株是得到可靠實驗數據的前提。作為細胞株保藏中心,監(jiān)測細胞株的質量一直是本細胞庫重點工作之一。

細胞株的微生物污染源一般有細菌、真菌、支原體。細菌和真菌污染細胞培養(yǎng)物時導致培養(yǎng)基變色,鏡下可以看到菌體。但細胞株感染支原后培養(yǎng)基通常不會有顏色變化,更不能在普通顯微鏡下觀察到。支原體會影響培養(yǎng)細胞的各項參數,甚至導致細胞株死亡,因此建立細胞庫支原體檢測體系以及支原體去除方法非常必要。

本研究結合本庫自身情況選用最易操作的三種方法:DNA染色、直接培養(yǎng)法、PCR,對本細胞庫保藏的常用的100種細胞株進行支原體檢測。根據各不同方法的優(yōu)缺點建立適用于本細胞庫的支原體檢測流程體系:入庫前PCR試劑盒預檢、入庫后三項全檢、日常兩項監(jiān)控、供應中自建PCR檢測。

在有支原體污染的細胞株中選取珍貴、稀有、且國內研究者急需求的細胞株為研究對象,同時使用BM-Cyclin和MC-210兩種藥劑去除支原體。在支原體去除后的一周、一個月、一年的時間段里,重復檢測支原體污染,用以評價兩種藥劑效果和優(yōu)缺點。通過對比,最終確定BM-Cyclin為細胞庫去除支原體污染的藥劑。

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