替爾泊肽作為胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）和葡萄糖依賴性促胰島素釋放肽（GIP）受體激動劑，是治療2型糖尿病的有效藥物，具有降血糖和減輕體重的作用。由于其臨床價值和藥理可靠性，GLP-1受體激動劑在全球制藥領(lǐng)域占據(jù)著穩(wěn)固的地位。因此，準(zhǔn)確的質(zhì)量控制至關(guān)重要，尤其是氨基酸序列和高級結(jié)構(gòu)對治療效果有重大影響。

本案例概述了替爾泊肽的方法分析開發(fā)過程。篩選方案評估了流動相中的pH值和有機(jī)溶劑、色譜柱溫度、固定相以及生物惰性色譜柱硬件的影響。

化合物信息

名稱：替爾泊肽

分子量：4813.45 Da

分子式：C₂₂₅H₃₄₈N₄₈O₆₈

結(jié)構(gòu)：

色譜篩選條件

色譜柱：

        YMC-Triart C18 (12nm, 1.9µm) 100 x 2.1mm ID

        YMC-Triart C8 (12nm, 1.9µm) 100 x 2.1mm ID

        YMC-Triart Bio C18 (30nm, 1.9µm) 100 x 2.1mm ID

流動相A：水溶液

流動相B：乙腈或者甲醇

梯度：1%B/min

流速：0.2ml/min

柱溫：40℃，60℃

進(jìn)樣量：2µl

樣品：替爾泊肽粗品（純度20.5%）和標(biāo)準(zhǔn)品（濃度2.0mg/ml，溶劑20mM碳酸氫銨溶液）

檢測波長：220nm

流動相不同PH的影響

色譜柱：YMC-Triart C18

流動相A：

0.1%三溶液（pH 2.0） /  0.1%甲酸氟乙酸溶液（pH 2.5）

20 mM乙酸銨溶液（pH 6.7） /  50 mM碳酸氫銨溶液（pH 8.0）

流動相B：乙腈或甲醇

柱溫：40℃

結(jié)果顯示，使用乙腈均能獲得更好的峰型。采用中性至弱堿性流動相可顯著提升分離效果，峰型更好。這可能是由于替爾泊肽在堿性溶液中具有良好的溶解性。乙酸銨和碳酸氫銨均有較好的分離效果，因此考慮用于進(jìn)一步優(yōu)化。

柱溫的影響

將色譜柱溫度從40℃提高到 60℃，可提高分辨率，峰寬更窄。（碳酸氫銨溶液不適用60℃柱溫條件）

色譜柱的影響

色譜柱：

YMC-Triart C18 (12 nm, 1.9 µm) 100 x 2.1 mm ID

YMC-Triart C8 (12 nm, 1.9 µm) 100 x 2.1 mm ID

YMC-Triart Bio C18 (30 nm, 1.9 µm) 100 x 2.1 mm ID

實驗結(jié)果顯示，使用孔徑更大的色譜柱YMC-Triart Bio C18，有利于替爾泊肽形成更好的峰型，從而更好的與后面的雜質(zhì)峰分離。在乙酸銨條件下，其分離度明顯提高，峰寬更窄。

生物惰性色譜柱的優(yōu)勢

在不同樣品濃度下對生物惰性涂層色譜柱與常規(guī)不銹鋼色譜柱進(jìn)行對比，結(jié)果表明，使用生物惰性涂層的YMC Accura色譜柱可獲得更高的峰面積和更好的峰型。推測是由于常規(guī)不銹鋼色譜柱內(nèi)壁存在非特異性吸附。

優(yōu)化分析條件

通過進(jìn)一步優(yōu)化梯度斜率和有機(jī)溶劑比例

色譜柱：YMC Accura Triart Bio C18 (30 nm, 1.9 µm) 100 x 2.1 mm ID

流動相A：20mM 乙酸銨溶液（pH 6.7）

流動相B：乙腈

梯度：36 - 44 %B (0 - 16 min)，100 %B (16 - 20 min)

流速：0.2ml/min

柱溫：60℃

進(jìn)樣量：2µl

樣品：替爾泊肽粗品（純度20.5%，2.0mg/ml）和

         標(biāo)準(zhǔn)品（0.5mg/ml，溶劑DMSO）

檢測波長：220nm

結(jié)論

本方法可穩(wěn)定準(zhǔn)確檢測替爾泊肽的純度。中性至弱堿性緩沖鹽體系在高溫條件下可獲得較高的分離度和尖銳的峰型。此外，即使微量進(jìn)樣，采用YMC Accura Triart Bio C18生物惰性涂層色譜柱仍能改善峰型并提高回收率。該方案同樣適用于其他GLP-1受體激動劑的方法開發(fā)，且滿足藥物分析法規(guī)要求。