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一、技術原理
Mich單鏈DNA定量檢測試劑盒基于熒光染料與單鏈DNA(ssDNA)的特異性結合實現(xiàn)定量檢測。其核心原理如下：
熒光染料結合機制
試劑盒中的熒光染料(如SYBR Green I類似物)可嵌入單鏈DNA的堿基對間，形成穩(wěn)定的染料-DNA復合物。當染料與單鏈DNA結合時，其熒光信號顯著增強(通常增強100-1000倍)，而游離染料的熒光極弱。通過檢測熒光強度，可間接反映單鏈DNA的濃度。
非特異性結合的局限性
需注意，該染料對雙鏈DNA(dsDNA)和RNA也可能產(chǎn)生弱結合信號，但試劑盒通過優(yōu)化染料濃度和反應體系，優(yōu)先檢測單鏈DNA。若樣本中存在大量雙鏈DNA或RNA，需通過預處理(如加熱變性)將其轉化為單鏈形式，或選擇特異性更高的探針法試劑盒。
標準曲線法定量
通過已知濃度的單鏈DNA標準品(如1-200 ng范圍)建立標準曲線，將待測樣本的熒光信號與標準曲線對比，計算樣本濃度。
二、操作指南
1. 實驗準備
試劑盒組分
濃縮檢測試劑(含熒光染料)
稀釋緩沖液
預稀釋的DNA標準品(1-200 ng范圍)
專用檢測管(推薦使用Mich Assay Tube，避免側壁標注干擾熒光信號)
儀器與耗材
熒光計或熒光酶標儀(需支持485 nm激發(fā)/520 nm發(fā)射波長)
移液器(覆蓋1-20 μL和100-200 μL量程)
DNase-free耗材(避免核酸酶污染)
樣本要求
樣本體積：1-20 μL
濃度范圍：50 pg/μL - 200 ng/μL(檢測范圍1-200 ng)
兼容性：可耐受鹽、游離核苷酸、溶劑、去污劑或蛋白等污染物，但需避免強酸強堿或高濃度變性劑(如尿素、甲酰胺)。
2. 實驗步驟
試劑與樣本準備
將試劑盒組分恢復至室溫(25℃)。
輕輕顛倒混勻檢測試劑，瞬時離心(避免渦旋振蕩產(chǎn)生氣泡)。
準備標準品：取10 μL標準品1(10 ng/μL)和標準品2(100 ng/μL)分別加入檢測管，補加190 μL稀釋緩沖液至終體積200 μL。
樣本檢測
取180-199 μL稀釋緩沖液加入樣本檢測管，加入1-20 μL待測樣本(終體積200 μL)。
輕輕渦旋振蕩3-5秒，避免產(chǎn)生氣泡。
室溫避光孵育2分鐘，使染料與單鏈DNA充分結合。
熒光信號讀取
將檢測管放入熒光計，選擇“ssDNA High Sensitivity”檢測程序。
記錄熒光信號值，根據(jù)標準曲線計算樣本濃度。
3. 注意事項
熒光淬滅控制
染料易受光降解，實驗全程需避光操作(如使用鋁箔包裹檢測管)。
檢測工作液配制后需在3小時內完成檢測，避免熒光信號衰減。
標準品與樣本處理
標準品需上下顛倒混勻后瞬時離心，避免沉淀影響濃度準確性。
樣本若含高濃度鹽或去污劑，建議用稀釋緩沖液進行1:10預稀釋。
污染防控
使用DNase-free耗材，避免核酸酶降解樣本。
實驗區(qū)域需分區(qū)操作(如配液區(qū)、樣本處理區(qū)、檢測區(qū))，防止交叉污染。
三、技術優(yōu)勢
高靈敏度
可檢測低至50 pg/μL的單鏈DNA，適用于痕量樣本(如循環(huán)腫瘤DNA、病毒基因組)的定量分析。
寬檢測范圍
線性檢測范圍達1-200 ng，覆蓋大多數(shù)實驗需求(如NGS文庫構建、qPCR模板定量)。
操作簡便
無需復雜純化步驟，直接混合樣本與檢測工作液即可讀數(shù)，單次檢測耗時<5分鐘。
污染物耐受性強
對鹽、蛋白、去污劑等常見污染物耐受閾值高，減少樣本預處理步驟。
四、Mich單鏈DNA定量檢測試劑盒應用場景
基因編輯與合成生物學
定量評估CRISPR-Cas9編輯后單鏈DNA修復模板的濃度。
液態(tài)活檢
檢測血漿中循環(huán)游離DNA(cfDNA)的單鏈片段比例，輔助腫瘤早期診斷。
NGS文庫構建
優(yōu)化文庫投入量，確保Illumina等平臺建庫成功率。
病毒學研究
定量分析病毒基因組單鏈RNA(如HIV、HCV)逆轉錄后的單鏈DNA中間體。
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