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基質(zhì)膠凝固不良？本文解析體內(nèi)移植/類(lèi)器官/血管生成三大場(chǎng)景稀釋比例，提供PBS無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋公式+操作避坑清單！
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一、通用稀釋原則（牢記核心參數(shù)）
? 稀釋液選擇優(yōu)先級(jí)：
冷無(wú)血清培養(yǎng)基 ＞ DMEM/F12 ＞ PBS（僅限體內(nèi)注射）
?? 禁忌：
- ? 含血清培養(yǎng)基（引發(fā)提前凝固）
- ? 高溫操作（＞10℃導(dǎo)致纖維蛋白變性）
二、不同實(shí)驗(yàn)場(chǎng)景稀釋比例表
實(shí)驗(yàn)類(lèi)型 | 推薦稀釋比例 | 終濃度 | 操作要點(diǎn) |
類(lèi)器官培養(yǎng) | 1:1 ~ 1:3 | 4-8 mg/mL | 預(yù)混細(xì)胞后點(diǎn)膠于預(yù)溫孔板 |
細(xì)胞3D侵襲實(shí)驗(yàn) | 1:8 ~ 1:10 | 1-2 mg/mL | Transwell上室鋪50μl |
體內(nèi)腫瘤移植 | 1:1 ~ 1:2 | 8-12 mg/mL | 冰上操作+注射器預(yù)冷 |
血管生成實(shí)驗(yàn) | 1:4 ~ 1:6 | 2-3 mg/mL | 96孔板每孔鋪30μl |
神經(jīng)干細(xì)胞分化 | 不稀釋 | 10-12 mg/mL | 4℃預(yù)鋪膠后37℃聚合30min |
> ?? 濃度換算公式：
> 終濃度 (mg/mL) = 原膠濃度 × [V<sub>膠</sub>/(V<sub>膠</sub>+V<sub>稀釋液</sub>)]
> （康寧基質(zhì)膠原液濃度約8-12 mg/mL，批號(hào)差異需查COA）
三、分步操作流程（防凝固核心技巧）
Step 1 解凍與混勻
1. 4℃冰箱解凍過(guò)夜（嚴(yán)禁37℃水?。。?
2. 預(yù)冷移液槍頭至4℃
3. 輕柔上下吹打≤10次（避免氣泡破壞層黏連蛋白）
Step 2 稀釋操作
Step 3 鋪膠固化
容器 | 推薦厚度 | 聚合條件 | 提示 |
96孔板 | 30-50μm | 37℃ × 30min | 傾斜板面檢查均一性 |
Transwell | 100μm | 37℃ × 1h | 下層加培養(yǎng)基防干裂 |
體內(nèi)注射 | 直接使用 | 體溫聚合 | 注射速度≤50μl/min |
四、4大高頻問(wèn)題急救方案
問(wèn)題1：膠體不凝固
- 根因：
- 操作溫度＞10℃ → 冰上重置操作臺(tái)
- 血清污染 → 更換無(wú)血清稀釋液
- 挽救步驟：
1. 回收膠體至冰上EP管
2. 補(bǔ)加 1/10體積未稀釋膠
3. 重新鋪板
問(wèn)題2：細(xì)胞懸浮不下沉
- 對(duì)策：
- 提高基質(zhì)膠濃度至 ≥6 mg/mL
- 添加 2mg/mL膠原蛋白I（增強(qiáng)錨定）
問(wèn)題3：膠內(nèi)出現(xiàn)裂紋
- 預(yù)防方案：
- 聚合后表面滴加 100μl培養(yǎng)基（防干燥）
- 避免移動(dòng)未wanquan固化的培養(yǎng)板
五、稀釋液替代方案（無(wú)血清環(huán)境）
添加劑 | 作用 | 推薦濃度 |
BD PuraMatrix | 增強(qiáng)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性 | 0.2-0.5% v/v |
海藻酸鈉 | 提升孔隙率 | 0.1% w/v |
層黏連蛋白 | 促進(jìn)干細(xì)胞貼壁 | 5μg/mL |
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