LC-MS/MS 外標(biāo)法檢測吲哚乙酸（IAA）是利用高效液相色譜（LC）的分離能力和串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）的高選擇性與高靈敏度相結(jié)合的分析方法。首先，通過液相色譜柱對樣品中的 IAA 進(jìn)行分離，使 IAA 與其他干擾物質(zhì)分離開來。隨后，分離后的 IAA 進(jìn)入串聯(lián)質(zhì)譜儀，在一級質(zhì)譜中被離子化形成母離子，母離子經(jīng)選擇后進(jìn)入碰撞室，與惰性氣體碰撞發(fā)生碎裂產(chǎn)生子離子，二級質(zhì)譜對特征子離子進(jìn)行檢測。

外標(biāo)法是通過配制一系列已知濃度的 IAA 標(biāo)準(zhǔn)溶液，在相同的色譜和質(zhì)譜條件下進(jìn)行檢測，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積（或峰高）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后根據(jù)樣品中 IAA 的峰面積（或峰高），從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得對應(yīng)的濃度，從而實(shí)現(xiàn)對樣品中 IAA 的定量分析。

儀器與試劑

（一）儀器

高效液相色譜 - 串聯(lián)質(zhì)譜儀（LC-MS/MS）：配備合適的色譜柱（如 C18 柱，2.1mm×150mm，3.5μm）、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱等。

天平：精度為 0.0001g。

超聲波提取儀。

高速離心機(jī)（轉(zhuǎn)速≥12000r/min）。

氮吹儀。

移液器（10μL、100μL、1mL、5mL 等）。

容量瓶（1mL、5mL、10mL、50mL、100mL 等）。

離心管（10mL、50mL）。

微孔濾膜（0.22μm，有機(jī)相）。

（二）試劑

吲哚乙酸（IAA）標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98%。

甲醇：色譜純。

乙腈：色譜純。

甲酸：色譜純。

超純水：由 Milli-Q 系統(tǒng)制備。

乙酸銨：分析純。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

儲備液的配制：準(zhǔn)確稱取一定量的 IAA 標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至一定體積，配制成濃度為 1.0mg/mL 的儲備液，置于 - 20℃冰箱中避光保存，有效期為 6 個(gè)月。

中間液的配制：準(zhǔn)確移取一定體積的儲備液，用甲醇稀釋定容，配制成濃度為 10μg/mL 的中間液，置于 4℃冰箱中避光保存，有效期為 1 個(gè)月。

工作標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別準(zhǔn)確移取不同體積的中間液，用甲醇 - 水（體積比 50:50）混合溶液稀釋，配制成濃度為 0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL 的系列工作標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

四、樣品處理

樣品采集與保存：采集含有 IAA 的樣品（如植物組織、土壤提取液等），立即置于液氮中冷凍，然后轉(zhuǎn)移至 - 80℃冰箱中保存，避免 IAA 降解。

樣品提?。悍Q取一定量的樣品（如 0.5g 植物組織）置于離心管中，加入 5mL 甲醇 - 水（體積比 80:20）提取液，渦旋混合 1min，超聲提取 30min（功率 300W，溫度 30℃）。

離心：提取后的樣品在 12000r/min 下離心 10min，取上清液置于另一離心管中。

重復(fù)提?。合驓?jiān)性偌尤?3mL 提取液，重復(fù)上述提取和離心步驟，合并兩次上清液。

濃縮：將合并的上清液用氮吹儀在 40℃下吹至近干，加入 1mL 甲醇 - 水（體積比 50:50）混合溶液復(fù)溶，渦旋混合 1min。

過濾：將復(fù)溶后的溶液通過 0.22μm 有機(jī)相微孔濾膜過濾，濾液置于進(jìn)樣瓶中，待測。

LC-MS/MS 檢測條件

（一）液相色譜條件

色譜柱：C18 柱（2.1mm×150mm，3.5μm）。

柱溫：30℃。

流動(dòng)相：A 相為 0.1% 甲酸水溶液，B 相為乙腈。

梯度洗脫程序：0-2min，5% B；2-10min，5%-95% B；10-12min，95% B；12-12.1min，95%-5% B；12.1-15min，5% B。

流速：0.3mL/min。

進(jìn)樣量：5μL。

（二）質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI），正離子模式。

離子源溫度：350℃。

噴霧電壓：4000V。

鞘氣壓力：35psi。

輔助氣壓力：10psi。

碰撞氣壓力：1.5mTorr。

監(jiān)測模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。IAA 的母離子為 m/z 176.1，子離子為 m/z 130.1（定量離子）和 m/z 144.1（定性離子），碰撞能量分別為 15eV 和 10eV。

測定步驟

儀器預(yù)熱：打開 LC-MS/MS 儀器，進(jìn)行預(yù)熱，確保儀器各項(xiàng)性能指標(biāo)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：按照濃度由低到高的順序，依次將系列工作標(biāo)準(zhǔn)溶液注入 LC-MS/MS 儀器中，每個(gè)濃度重復(fù)進(jìn)樣 3 次，記錄對應(yīng)的峰面積。以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，平均峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測定：將處理好的樣品溶液注入 LC-MS/MS 儀器中，按照上述檢測條件進(jìn)行測定，記錄樣品中 IAA 的峰面積。每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)樣 3 次，取平均峰面積。