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基于Bradford考馬斯亮藍染料的蛋白定量 

Bradford 法又稱考馬斯亮藍法，用于快速，簡便的蛋白質(zhì)定量。這種定量方法在室溫進行，無需特殊儀器。將配制好的考馬斯亮藍 G-250 檢測試劑加入標準品和待測樣品中，經(jīng)過短暫的室溫孵育即可在 595 nm 處測定吸光值。Bradford 法蛋白定量與蛋白質(zhì)樣品中常見的鹽離子、溶劑、緩沖液、硫醇、還原性物質(zhì)和金屬螯合劑相兼容。 

Bradford Plus蛋白定量試劑盒全新推出內(nèi)含免稀釋蛋白標準品的版本，不用稀釋標準品、縮短標準曲線制作時間、減少移液失誤。 免稀釋蛋白標準品是一組與排槍兼容的預(yù)稀釋標準品，使您可以輕松地將稀釋好的標準品一步轉(zhuǎn)移到微孔板中。 

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Pierce 免稀釋蛋白定量產(chǎn)品可大幅減少傳統(tǒng)定量實驗中繁瑣的稀釋操作，并使用來自美國國家標準與技術(shù)研究院 (NIST) 的純化 BSA進行校準，以確保標準曲線的準確性。 

Bradford 法定量原理 

Marion Bradford 博士于 1976 年提出了使用考馬斯 G-250 染料作為比色試劑對總蛋白進行檢測和定量的方法。Pierce Coomassie Bradford 蛋白定量試劑盒是基于 Bradford 博士首先報道的試劑而優(yōu)化。 

Bradford 試劑, 基于考馬斯的蛋白定量 

在酸性環(huán)境中，蛋白質(zhì)結(jié)合考馬斯染料。這導(dǎo)致染料的最大吸收發(fā)生位移，從紅棕色形式（最大吸收峰 465nm）轉(zhuǎn)化為藍色形式（最大吸收峰 610nm）。染料的兩種形式在 595nm 處差異最大，因此 595nm 是測定考馬斯染料-蛋白復(fù)合物的藍色的最佳波長。如有必要，可以 575nm 到 615nm 之間的任意波長測量該染料的藍色。在兩個波長（575nm 和 615nm）下，與在 595 nm 處獲得的顏色（吸光度）相比，測得的顏色量（吸光度）降低了大約 10％?；诳捡R斯染料的蛋白質(zhì)檢測法中，顏色的形成是與某些堿性氨基酸（主要是精氨酸、賴氨酸和組氨酸）有關(guān)。范德華力和疏水相互作用也影響染料-蛋白質(zhì)的結(jié)合。結(jié)合到每個蛋白質(zhì)分子上的考馬斯染料分子數(shù)大致與蛋白所帶正電荷的數(shù)量成正比。游離氨基酸、肽和低分子量蛋白質(zhì)不會與考馬斯染料試劑產(chǎn)生顏色。一般情況下，肽或蛋白質(zhì)的質(zhì)量必須大于 3,000 道爾頓才能被該試劑檢出。在某些應(yīng)用中，這是一個優(yōu)點。 

圖 1.基于考馬斯染料的 Bradford 蛋白檢測的反應(yīng)示意圖：Pierce Coomassie（Bradford 法）蛋白檢測, Pierce Coomassie Plus（Bradford 法）蛋白檢測, 和 Pierce 去垢劑兼容的 Bradford 檢測。 

考馬斯蛋白檢測法的主要缺點是它們與常規(guī)用于溶解膜蛋白的表面活性劑濃度不兼容。通常，當樣品中存在去垢劑時，即使?jié)舛群艿?，也會?dǎo)致該試劑形成沉淀?？梢允褂?/span> 去垢劑兼容型Bradford定量試劑來克服此限制。另外，Coomassie 染料試劑是強酸性的，所以酸溶解度較差的蛋白不能用該試劑來測定。最后，Coomassie 試劑導(dǎo)致的蛋白間差異性大約是基于銅螯合的檢測試劑的兩倍。 

產(chǎn)品推薦 

Bradford Plus蛋白定量試劑盒（內(nèi)含免稀釋標準品） 

Bradford Plus蛋白定量試劑盒全新推出內(nèi)含免稀釋蛋白標準品的版本，不用稀釋標準品、縮短標準曲線制作耗時。我們提供內(nèi)含免稀釋 BSA 蛋白標準品的 Bradford Plus 蛋白定量試劑盒，也可單獨購買免稀釋標準品、搭配任何 Pierce Bradford 試劑盒一起使用。 

圖 2. 使用Bradford Plus蛋白定量試劑盒（內(nèi)含免稀釋標準品）進行蛋白定量實驗。 

去垢劑兼容型 Bradford 檢測 

Pierce 去垢劑兼容型 Bradford 定量試劑盒是 Bradford考馬斯染料結(jié)合比色法進行快速，即用的改進，用于總蛋白質(zhì)定量。該配方與濃度高達 1％ 的常用去垢劑兼容。將 Pierce 去垢劑兼容型 Bradford 檢測與 Bio-Rad Dc 蛋白檢測進行比較，使用 Pierce 去垢劑兼容型 Bradford 定量（使用常規(guī)去垢劑）時，靈敏度更高。Pierce 去垢劑兼容型 Bradford 檢測的標準曲線范圍是 Bio-Rad DC 檢測范圍的 4 倍。 

圖 2.Bradford 蛋白定量 vs. Bio-Rad DC 蛋白定量每個定量檢測均在微孔板上使用加有去垢劑或水（對照）的 BSA 標準品進行，并遵循制造商的說明。 

表 1.比較 Pierce 去垢劑兼容型 Bradford 定量試劑盒與 Bio-Rad DC 蛋白定量試劑盒。 

660 nm法 

Pierce 660 nm 定量原理 

Pierce 660 nm 定量試劑 

Pierce 660nm 蛋白檢測基于酸性條件下的染料-金屬復(fù)合物與蛋白質(zhì)的結(jié)合，這種結(jié)合會導(dǎo)致染料在 660 nm 處的最大吸收吸收發(fā)生位移。該染料-金屬復(fù)合物為紅褐色，在與蛋白結(jié)合后變?yōu)榫G色。這種顏色的變化是由于染料在低 pH 值時的脫氫導(dǎo)致的，而蛋白內(nèi)的帶正電荷的氨基酸殘基和帶負電的染料-金屬復(fù)合物的相互作用促進了這一過程。因此，該染料主要與蛋白質(zhì)中的堿性殘基（例如組氨酸，精氨酸和賴氨酸）相互作用，而與酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸相互作用程度相對較小。 

即使在存在與 Bradford 和 BCA 蛋白檢測不兼容的去垢劑和還原劑的情況下，檢測中產(chǎn)生的顏色也很穩(wěn)定并在很大范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)濃度成正比。可以將可選的 IDCR 添加到檢測試劑中，以增加與大量離子去垢劑的相容性，從而可以測量含有 Laemmli SDS 樣品緩沖液和溴酚藍的樣品。IDCR 通過混合溶解，對檢測沒有任何影響。 

圖 3.660 nm 檢測試劑-金屬復(fù)合物的最大吸光度與所結(jié)合的 BSA 成正比。當試劑-金屬復(fù)合物存在時，蛋白質(zhì)在 660 nm 波長處產(chǎn)生明顯的吸光度偏移。 

使用 Pierce 660nm 蛋白檢測試劑盒進行蛋白定量 

Pierce 660 nm 檢測試劑盒比基于考馬斯的 Bradford 檢測具有更出色的線性，并且與更高濃度的大多數(shù)去垢劑、還原劑和其他常用試劑兼容。附件的離子去垢劑兼容性試劑（IDCR）提供了更廣泛的去垢劑兼容性，這使其成為一種適用于含有 Laemmli SDS 樣品緩沖液和溴酚藍的樣品的蛋白檢測方法。盡管 Pierce 660 nm 蛋白檢測產(chǎn)生的蛋白質(zhì)間變異性比其他檢測法（如 BCA 蛋白檢測法）高（37％），但更簡單的單試劑形式和更廣泛的物質(zhì)相容性使 Pierce 660 nm 蛋白檢測法更適合許多常規(guī)應(yīng)用。Pierce 660nm 蛋白檢測可以以試管或微孔板的形式進行。 

圖 4.性能比較和典型顏色響應(yīng) 

A：Bio-Rad Bradford 蛋白檢測與 Thermo Scientific Pierce 660nm 蛋白檢測的性能比較。根據(jù)標準試管程序，使用 100 µL BSA 進行測定與 Bradford 檢測（125 至 1000 µg）相比，Pierce 660nm 蛋白檢測的線性范圍更寬（25 至 2000 µg）。在每種檢測的適當波長（分別為 660nm 和 595nm）下測量吸光度。使用試管程序的典型顏色響應(yīng)曲線 

B：使用試管程序的典型顏色響應(yīng)曲線。牛血清白蛋白（BSA）的線性檢測范圍為 25 至 2000 µg/mL，牛丙種球蛋白（BGG）的線性檢測范圍為 50 至 2000 µg/mL。由于所有蛋白質(zhì)檢測固有的蛋白質(zhì)間變異性（對于 660nm 蛋白質(zhì)檢測為 37％），這表明應(yīng)該為要測量的未知樣品類型使用適當?shù)臉藴势贰?/span> 

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