如何判斷 SDS-PAGE 凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果
凝膠完整性:實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,首先觀察凝膠是否完整,有無(wú)破損、斷裂或脫落現(xiàn)象。若凝膠存在明顯破損,可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)樣品在電泳過(guò)程中泄漏或遷移路徑改變,使結(jié)果無(wú)法準(zhǔn)確反映樣品真實(shí)情況,此時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信度低,需重新實(shí)驗(yàn)。
凝膠透明度:正常情況下,凝膠應(yīng)具有良好的透明度,便于觀察條帶。若凝膠出現(xiàn)渾濁、發(fā)白等情況,可能是凝膠制備過(guò)程中存在問題,如試劑不純、聚合不充分等,這會(huì)影響條帶清晰度,導(dǎo)致難以準(zhǔn)確分析蛋白質(zhì)分離情況。
溴酚藍(lán)位置:溴酚藍(lán)作為常用指示劑,其遷移位置可作為判斷電泳進(jìn)程的參考。在常規(guī) SDS-PAGE 電泳中,溴酚藍(lán)在不同濃度凝膠中的遷移速度有一定規(guī)律,例如在 10% - 12% 的聚丙烯酰胺凝膠中,其遷移位置大致相當(dāng)于 3 - 5 kDa 的蛋白質(zhì)。若溴酚藍(lán)遷移至凝膠底部或異常位置,需結(jié)合具體情況分析。若過(guò)早到達(dá)底部,可能是電泳時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或電壓過(guò)高,導(dǎo)致小分子蛋白質(zhì)可能跑出凝膠,影響結(jié)果完整性;若遷移過(guò)慢,則可能是電壓過(guò)低或凝膠濃度異常。
條帶清晰度:清晰、銳利的蛋白質(zhì)條帶是實(shí)驗(yàn)成功的重要標(biāo)志。若條帶模糊、彌散,可能是由于樣品濃度過(guò)高,導(dǎo)致蛋白質(zhì)在凝膠中堆積,無(wú)法有效分離;也可能是電泳緩沖液使用不當(dāng)、凝膠聚合不均勻或電泳過(guò)程中溫度過(guò)高等原因。此外,樣品中存在雜質(zhì)、蛋白質(zhì)降解等情況,也會(huì)造成條帶不清晰。
條帶數(shù)量與位置:根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蜆悠奉A(yù)期,判斷條帶數(shù)量和位置是否合理。對(duì)于已知成分的樣品,若條帶數(shù)量缺失,可能是某些蛋白質(zhì)未被有效分離或在樣品處理過(guò)程中丟失;若出現(xiàn)額外條帶,可能是樣品污染、蛋白質(zhì)發(fā)生修飾或降解產(chǎn)生新的片段。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量 Marker 對(duì)比條帶位置,可估算目標(biāo)蛋白質(zhì)的分子量,若估算值與預(yù)期值偏差較大,需檢查實(shí)驗(yàn)過(guò)程是否存在問題。
條帶強(qiáng)度:條帶的強(qiáng)度(顏色深淺)在一定程度上反映了蛋白質(zhì)的含量。同一樣品不同泳道中,若條帶強(qiáng)度差異明顯,可能是上樣量不一致導(dǎo)致;對(duì)于不同樣品的條帶,強(qiáng)度對(duì)比可初步反映蛋白質(zhì)表達(dá)量的差異,但需注意,條帶強(qiáng)度還受染色效果、曝光時(shí)間等因素影響,因此如需準(zhǔn)確分析蛋白質(zhì)含量,還需結(jié)合定量方法進(jìn)一步驗(yàn)證。
標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量 Marker:實(shí)驗(yàn)中通常會(huì)加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量 Marker 作為參照,其包含一系列已知分子量的蛋白質(zhì)條帶。通過(guò)將樣品條帶與 Marker 條帶對(duì)比,可準(zhǔn)確判斷樣品中蛋白質(zhì)的分子量范圍,評(píng)估電泳分離效果。若 Marker 條帶分離異常,如條帶扭曲、重疊,可能是凝膠質(zhì)量問題或電泳條件不合適,此時(shí)基于 Marker 得出的樣品分子量判斷也會(huì)不準(zhǔn)確。
陽(yáng)性與陰性對(duì)照:在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí),設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照有助于判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)出現(xiàn)預(yù)期的蛋白質(zhì)條帶,若未出現(xiàn),則可能是實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程存在問題,如樣品處理不當(dāng)、電泳條件不合適等;陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)目標(biāo)條帶,若出現(xiàn)條帶,則提示可能存在樣品污染或非特異性反應(yīng),需要對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程進(jìn)行排查和優(yōu)化。
相關(guān)產(chǎn)品
免責(zé)聲明
- 凡本網(wǎng)注明“來(lái)源:化工儀器網(wǎng)”的所有作品,均為浙江興旺寶明通網(wǎng)絡(luò)有限公司-化工儀器網(wǎng)合法擁有版權(quán)或有權(quán)使用的作品,未經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)不得轉(zhuǎn)載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)使用作品的,應(yīng)在授權(quán)范圍內(nèi)使用,并注明“來(lái)源:化工儀器網(wǎng)”。違反上述聲明者,本網(wǎng)將追究其相關(guān)法律責(zé)任。
- 本網(wǎng)轉(zhuǎn)載并注明自其他來(lái)源(非化工儀器網(wǎng))的作品,目的在于傳遞更多信息,并不代表本網(wǎng)贊同其觀點(diǎn)和對(duì)其真實(shí)性負(fù)責(zé),不承擔(dān)此類作品侵權(quán)行為的直接責(zé)任及連帶責(zé)任。其他媒體、網(wǎng)站或個(gè)人從本網(wǎng)轉(zhuǎn)載時(shí),必須保留本網(wǎng)注明的作品第一來(lái)源,并自負(fù)版權(quán)等法律責(zé)任。
- 如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題,請(qǐng)?jiān)谧髌钒l(fā)表之日起一周內(nèi)與本網(wǎng)聯(lián)系,否則視為放棄相關(guān)權(quán)利。