人細胞毒素相關(guān)蛋白A （CagA）檢測試劑盒
（美國DRG進口原裝，貨號：EIA 4138）
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酶聯(lián)檢測人血清或血漿中抗CagA IgG抗體

實驗原理
此試劑盒基于酶聯(lián)免疫法，采用HRP酶聯(lián)物；*次孵育中，樣本中的抗CagA IgG 抗體與包被的CagA 抗原結(jié)合，洗板除去未結(jié)合的，再次孵育，二抗（過氧化物酶標記的抗人IgG）與CagA-抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合，再次洗板后，無色的顯色劑（TMB）底物液加入微孔內(nèi)，與過氧化物酶反應(yīng)生成了有顏色的復(fù)合物，加入硫酸終止顏色反應(yīng)，酶標儀450nm和405nm處檢測顏色強度，標準品和樣本中的抗CagA IgG 抗體濃度與顏色強度成正比
 
試劑盒組成
足夠用于96人份的試劑
試劑盒貯存于2-8℃
各試劑有效期見試劑瓶標簽
試劑盒一旦開封，在2-8℃下可保存2個月
 
 

1. 【MTP】包被板，96孔，包被有CagA抗原（重組DNA獲得），未用的板條保存于密封袋內(nèi)2-8℃下
2. 【CAL】標準品，6瓶，1.5ml/瓶，抗CagA IgG 血清基質(zhì)，濃度為0;15;30;60;120;240 RU/ml，即用，紅色，*（＜0.1%）作為防腐劑
3. 【CONJ】酶聯(lián)物，1瓶，14ml，HRPO標記的小鼠單抗抗人IgG，TRIS 緩沖液，穩(wěn)定劑，即用，粉色，新霉素作為防腐劑
4. 【WASH】洗滌緩沖液（濃縮），1瓶，50ml，PBS-吐溫20 ，硫柳汞（＜0.05%）作為防腐劑，使用前，用蒸餾水1:20比例稀釋；若出現(xiàn)不溶解的晶體，則需在37℃下溫育數(shù)分鐘；稀釋的洗滌液可在2-8℃下保存30天
5. 【DIL】樣本稀釋液（濃縮，）1瓶，20ml，血清基質(zhì)，穩(wěn)定劑，紅色，*（＜0.1%）作為防腐劑，使用前以稀釋的洗滌液1:20比例稀釋；稀釋的樣本稀釋液2-8℃下可保存30天
6. 【TMB】顯色劑，2瓶，15ml，含檸檬酸-磷酸緩沖液，DMSO和H₂O₂的TMB，即用
7. 【STOP】封閉液，1瓶，14ml，1N的硫酸，即用
8. 【CPA】蓋板
9. 塑料包裝袋

 
實驗所需材料但試劑盒未提供
 

1. 帶一次性槍頭的可調(diào)的，自動的微量移液器
2. 干燥箱，調(diào)節(jié)至37±2℃
3. 用于試劑稀釋的刻度容器
4. 抽吸式泵或自動洗板設(shè)備
5. 酶標儀（450nm和405nm）
6. 坐標紙
7. 蒸餾水

 
此實驗還可以用自動酶標儀進行操作
 
樣本采集與準備
試驗可檢測血清或血漿樣本
適量的脂血樣本不會影響結(jié)果，高含量的脂血或溶血樣本可能會影響試驗，纖維蛋白絲會干擾試驗；確保檢測前樣本是清澈的，樣本在2-8℃下可保存1周，想要保存更長時間建議凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融
使用前：以1:300的比例用先前已稀釋的樣本稀釋液進行樣本稀釋
     （如：10 ul 樣本+ 2990 ul的稀釋液）
 
實驗步驟
試劑和樣本平衡至室溫
使用前來回倒置混勻樣本
 

1. 準備的微孔：空白，標準品和樣本
2. 加100 ul 的標準品和先前稀釋的樣本于相應(yīng)的微孔內(nèi)

   注意：標準品不用稀釋
 

1. 空白孔內(nèi)加100 ul 的樣本稀釋液
2. 用試劑盒內(nèi)提供的膠粘紙張蓋住包被板，37±2℃下孵育60±5 min
3. 350 ul的稀釋的洗滌液，洗板4次，吸走微孔內(nèi)的所有液體
4. 每孔加100 ul的酶聯(lián)物
5. 用試劑盒內(nèi)提供的膠粘紙張蓋住包被板，37±2℃下孵育30±2 min
6. 按照步驟5）洗板
7. 每孔加100 ul的顯色劑
8. 37±2℃下孵育15 min，避免直射陽光
9. 每孔加100 ul的封閉液
10. 采用合適的酶標儀在50nm處讀取吸收值，參考波長620nm（以空白對照孔校零），萬一出現(xiàn)了吸收值溢出，則選擇在405nm處讀數(shù)；試驗操作結(jié)束15min內(nèi)必須完成讀數(shù)

（若采用的是自動酶標板設(shè)備，依據(jù)相關(guān)手冊操作）
 
實驗操作圖

包被孔	空白	標準品	樣本
試劑
標準品	-	100 ul	-
稀釋的樣本	-	-	100 ul
樣本稀釋液	100 ul	-	-
孵育：37±2 ℃，60±5 min
洗板：4 x 350 ul
酶聯(lián)物	100 ul	100 ul	100 ul
孵育：37±2 ℃，30±2 min
洗板：4 x 350 ul
顯色劑	100 ul	100 ul	100 ul
孵育：37℃，15 min
封閉液	100 ul	100 ul	100 ul
讀數(shù)：450 nm

 
 
結(jié)果計算
線性坐標紙上以標準品的濃度為X軸，吸收值為Y軸，繪制標準曲線；相應(yīng)的抗-CagA IgG抗體濃度（RU/mL）根據(jù)各樣本吸收值從標準曲線獲得
 

1. 樣本IgG 值小于10 RU/mL，則判定為抗CagA IgG 抗體無反應(yīng)
2. 樣本IgG 值10 -15 RU/mL，則判定為弱反應(yīng)
3. 樣本IgG 值高于15 RU/mL，則判定為抗CagA IgG 抗體有反應(yīng)

 
計算示例
以下數(shù)值僅供演示示例，不能用于代替實驗數(shù)值
 
通過標準曲線得到樣本抗CagA IgG 抗體滴度為70 RU/mL
 
驗證標準
結(jié)果計算之前，先確保質(zhì)控吸收值在以下期望值范圍內(nèi)

描述	期望值
陰性質(zhì)控	＜0.100
OD 值之比（標準品240  RU/mL/標準品15  RU/mL）	＞2.5
OD 值之比（標準品15  RU/mL/標準品0  RU/mL）	＞3.5

若數(shù)值不在期望值范圍內(nèi)，需重新實驗
 
 
本譯文僅供參考，請以原說明書為準
 
 
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