甲醛變性電泳檢測(cè)RNA完整性
一、材料、試劑和儀器
1、材料:植物總RNA 5-10μg
2、試劑:
1)加樣運(yùn)載緩沖液(Loading buffer)
50% 甘油
1mmol/L EDTA (pH 8.0)
0.25%溴酚藍(lán)
25%二甲苯氰FF
2)10×TAE Buffer
3)5×甲醛凝膠電泳緩沖液:
0.1mol/L MOPs (pH7.0)
40mmol/L乙酸鈉
5mmol/L DETA(pH8.0)
4)甲醛,甲酰胺
3、儀器:電泳裝置,紫外透射觀測(cè)儀
二、實(shí)驗(yàn)程序
1、甲醛變性的瓊脂糖(Agarose) 凝膠的配制
在250mL的錐形瓶中準(zhǔn)確稱量2g Agarose (Sigama),再加20mL 10×TAE Buffer,144mLDEPC處理過(guò)的雙蒸水,微波爐中化膠,待冷卻至50-60℃加EB至終濃度≤0.5μg/mL。在通風(fēng)櫥中加入36 mL甲醛,放置一段時(shí)間以減少甲醛蒸汽。
2、RNA的甲醛變性電泳
1) 樣品制備
RNA總量10μg
5×甲醛凝膠電泳緩沖液4μl
甲醛 3.5μl
甲酰胺10μl
加入無(wú)菌離心管中混合,95℃水浴變性2min(或55℃,15min),取出后放入冰中冷卻。
2) 加入2μl無(wú)菌的DEPC處理的加樣運(yùn)載液。(使用加樣運(yùn)載液的目的有三: 增大樣品密度,以確保DNA均勻進(jìn)入樣品孔內(nèi);使樣品呈現(xiàn)顏色,便于加樣操作;能明確顯現(xiàn)樣品在電泳膠上的泳動(dòng)位置。以 0.5 X TBE作電泳液時(shí),溴苯酚在瓊脂糖中的泳動(dòng)速率與長(zhǎng) 300 bp 的雙鏈線狀DNA相同,而二甲苯氰FF 的泳動(dòng)速率與長(zhǎng)4kb 的雙鏈線狀DNA相同。)
3)將膠板浸沒(méi)在1×甲醛凝膠電泳緩沖液中,點(diǎn)樣前5V/cm預(yù)跑5min。點(diǎn)樣后3-4V/cm電泳。
4)電泳結(jié)束后(溴苯酚藍(lán)遷移到約8cm處),紫外燈下觀察, 照相。
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