填補(bǔ)Qiagen空白、不用DNA酶消化的植物RNA提取試劑盒
一般公司多糖多酚植物RNA提取試劑盒失敗原因和解決方案
很多植物RNA的樣品由于含有大量的多糖、多酚、代謝產(chǎn)物、色素等成分，造成RNA提取過程中氧化、褐化、降解、由于植物品種的多樣性造成情況更 加復(fù)雜。手工的CTAB類的方法提取因?yàn)闀r(shí)間太長，太繁瑣，手工方法不在討論之列。一直以來沒有一款好的試劑盒包括qiagen、promega等進(jìn)口試 劑盒也無法滿足科研工作者對(duì)植物RNA提取的要求。
下面我們來分析一下植物RNA為什么不能提取成功的原因：
市面上zui常見的RNA提取試劑盒無非是兩種：*種：TRIzol改良類方法（包括溶液型的和離心柱型的）、第二種：直接裂解過柱子的方法（離心柱）
*種試劑盒失敗的原因1：RNA市面上面zui流行的方法就是TRIzol，或者TRIzol改良，或者TRIzol加離心柱一類的改良方法。 TRIzol也就是異硫*酸胍/苯酚/氯仿原理一步法的方法的對(duì)象是動(dòng)物源性的組織細(xì)胞，針對(duì)普通多糖多酚低的植物性的材料，TRIzol類原理產(chǎn) 品也可以提取。但是多糖、多酚、次級(jí)代謝產(chǎn)物豐富的情況下，TRIzol類方法無法防止多糖多酚對(duì)于RNA/DNA分相的干擾，要么殘留大量DNA，要么 殘留大量多糖、多酚或者次級(jí)代謝產(chǎn)物，氧化破壞RNA，或者殘留這些多糖多酚，色素代謝產(chǎn)物等抑制下游的反轉(zhuǎn)錄等反應(yīng)。限于技術(shù)水平的限制，市面上絕大多 數(shù)的國產(chǎn)廠家是使用TRIzol的方法進(jìn)行改良，無論是不是加了離心柱。但是實(shí)踐證明，改良不能從根本上解決問題。判斷是否試劑盒使用這種改良的方法非常 簡單：是否裂解液含有苯酚的味道和使用氯仿，如果使用到了氯仿就是TRIzol方法的改良。
第二種試劑盒失敗的原因：直接裂解過柱子的方法是目前的方法，但是也是技術(shù)含量zui高的方法。這個(gè)方法采用裂解液（不含苯酚，氯仿）直接裂 解，RNA/DNA同時(shí)過柱子，然后在柱子上面直接分離RNA/DNA，所以，這種方法的優(yōu)點(diǎn)*在于，避免了使用trizol在多糖多酚下不能成功分離 RNA/DNA的弊端、第二在于，不使用有毒的苯酚氯仿。但是正是因?yàn)槠浼夹g(shù)先進(jìn)，所以難度很高，國內(nèi)廠家包括進(jìn)口公司有兩個(gè)技術(shù)難點(diǎn)一直沒有突破。第 一，裂解液的成分必須針對(duì)去除多糖多酚進(jìn)行研發(fā)添加去多糖多酚，代謝產(chǎn)物成分。否則會(huì)同樣碰到多糖多酚干擾提取的問題。第二、和TRIzol原理不同，直 接過柱法DNA/RNA同時(shí)加到吸附柱上去。如何去除DNA是*個(gè)難點(diǎn)。否則會(huì)殘留大量DNA。兩個(gè)技術(shù)難點(diǎn)的沒有掌握導(dǎo)致了國內(nèi)公司包括的第二種試劑 盒失敗。國外公司因?yàn)闆]有掌握*難點(diǎn)，裂解液里面沒有去除多糖多酚成分，所以包括Qiagen的RNeasy plant mini kit盒子也常常不能成功提取較復(fù)雜植物RNA樣品如黑加侖、冬青等植物樣品。
上海恒遠(yuǎn)的研發(fā)人員經(jīng)過3年的不斷研發(fā)改良，針對(duì)多糖多酚植物的特點(diǎn)，和這兩種試劑盒失敗的原因，開發(fā)出了世界水平的RN09 EASYspin植物RNA快速提取試劑盒，*：采用直接過柱子方法，*拋棄了TRIzol苯酚，氯仿原理方法，使用無毒原料，并且添加了有自主知識(shí) 產(chǎn)權(quán)的去除多糖多酚成分解決了多糖多酚和代謝產(chǎn)物對(duì)于RNA的破壞和干擾分離。第二：突破了直接過柱子的方法DNA去除的技術(shù)難點(diǎn)，解決了DNA殘留過多 問題。經(jīng)過實(shí)踐過程中，幾十種國內(nèi)外試劑盒包括Qiagen的RNeasy mini kit 提取失敗的例子，包括棉花蘋果等試劑盒不易提取的樣品，使用上海恒遠(yuǎn)的EASYspin植物RNA提取試劑盒，20分鐘可以輕松提取，不需要液氮， 無苯酚氯仿。高質(zhì)量的RNA可以成功完成下游反應(yīng)試驗(yàn)。第三：實(shí)踐過程中我們發(fā)現(xiàn)，部分復(fù)雜植物或者DNA含量特別豐富的植物樣品使用Qiagen的 RNeasy plant mini kit 會(huì)有明顯殘留。嘗試北京艾德萊的RN09 EASYspin植物RNA快速提取試劑盒也一樣有明顯殘留。對(duì)此問題Qiagen并沒有提供的解決方案。Qiagen只是建議使用傳統(tǒng)的DNA酶消 化的方法來解決，但是*DNA酶消化的方法非常繁瑣，費(fèi)時(shí)間，消化后要回收，效果不好，還常常降解RNA，讓人望而生畏，而且成本高昂，單單 Qiagen的配套DNA酶柱上消化試劑盒就要1100元/50次，如果還要使用RNA清潔純化回收DNA酶消化后的盒子就更昂貴了。近年來北京艾德萊又 投入大量研發(fā)人力物力，終于*并且推出RN38 EASYspin plus 植物RNA提取試劑盒解決了DNA殘留問題，該試劑盒使用基因組DNA清除柱子，配合*研發(fā)的溶液，不需要DNA酶消化，操作簡單僅需增加10秒鐘清除 基因組DNA殘留的步驟，不用苯酚，氯仿，30分鐘完成全部試驗(yàn)過程。我們測(cè)試的幾種植物樣品中均已經(jīng)獲得成功，使用Qiagen的RNeasy plant mini kit 和我們RN09 EASYspin 植物RNA提取試劑盒有殘留DNA的樣品種類使用這款RN38 EASYspin plus 植物RNA提取試劑盒后，均無DNA殘留。
部分成功樣品：
棉花、海棠、黑加侖、煙草、擬南芥、虎杖、大豆、草莓、冬青、月季、薔薇、沙棘、冬棗、蘆薈、仙人掌、報(bào)春花、水稻、玉米、唐菖蒲、櫻桃、白玉 蘭、毛白楊、櫻花、葡萄、百合花、紫菜、綠藻、香蕉、水仙花、青花菜、地被菊、蘋果、梅花、番茄、石斛、毛桃、苧麻等等，其中qiagen無法提取的黑加 侖、promega無法提取的海棠等、均可用該產(chǎn)品成功提取。
推薦：上海恒遠(yuǎn)的RN09 EASYspin 植物RNA提取試劑盒為*產(chǎn)品，世界水平，不使用苯酚，氯仿有毒性物質(zhì)，采用離心柱型操作，添加有自主創(chuàng)新的多糖多酚去除成分，是多糖多酚樣品的特 效產(chǎn)品，不需要液氮，20分鐘內(nèi)得到高質(zhì)量RNA。成功提取Promega無法提取的海棠葉片、Qiagen無法提取的黑加侖等樣品。是國產(chǎn)試劑趕超世界 較高水平的一個(gè)典型例子。同時(shí)上海恒遠(yuǎn)推出的RN38 EASYspin Plus植物RNA提取試劑盒進(jìn)一步解決了Qiagen的RNeasy plant mini kit 部分植物樣品殘留大量DNA污染的問題，采用了的方法10秒鐘解決殘留問題，是上海恒遠(yuǎn)核酸分離技術(shù)遙遙的又一個(gè)里程碑，處于世界水平。