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Western Blotting的常見問題及解決方法
| 問 題 | 出現(xiàn)的原因 | 解決方法 |
| 1. 膠片上存在反轉印象 （如:亮的條帶.黑的背景） | HRP的濃度過高 | 稀釋HRP至少10倍 |
| 2. 膜上有黃色或棕色的沉積 | HRP的濃度過高 | 稀釋HRP至少10倍 |
| 3. 在暗室中條帶過于明亮 | HRP的濃度過高 | 稀釋HRP至少10倍 |
| 4. 條帶的發(fā)光時間持續(xù)了至 少8小時 | HRP的濃度過高 | 稀釋HRP至少10倍 |
| 5. 信號太弱或沒有 | 1.太多的HRP積聚導致信號快速的消退 2.抗原或抗體的濃度不夠 3.轉印不成功 4.HRP或其他底物的效價降低 | 1.稀釋HRP至少10倍 2.增加其濃度 3.尋找合適的轉移方法和條件 4.選擇其他的合適底物 |
| 6. 背景高 | 1.HRP濃度過高 2.封閉無效 3.不適合的封閉試劑 4.洗滌不充分和洗滌液的量 5.膠片曝光過度 6.抗原或抗體的濃度太高 | 1.稀釋HRP至少10倍 2.尋找合適的封閉方法 3.選用其他的封閉試劑 4.增加洗滌的時間,次數(shù)5.減少曝光時間 6.稀釋抗原或抗體 |
| 7. 蛋白質(zhì)條帶上 有空泡影像 | 1.蛋白質(zhì)沒有被充分轉印 2.膜沒有預先浸濕 3.在膠片和膜之間有氣泡 | 1.尋找合適的轉移方法和條件 2.在轉印前充分浸濕 3.在暴光之前趕走氣泡 |
| 8. 膠片上背景彌散 | HRP標記的抗體出現(xiàn)了積聚 | 用0.2μL的濾膜過濾HRP標記的抗體 |
| 9. 無特異性條帶 | 1.HRP濃度過高 2.SDS促使非特異蛋白質(zhì)條帶黏附在目的蛋白質(zhì)條帶上 | 1.稀釋HRP至少10倍 2.在操作過程中不要加SDS |
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