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細(xì)胞破碎的方法
機(jī)械法
主要通過(guò)機(jī)械切力的作用使組織細(xì)胞破碎的方法，常用的器械有組織搗碎機(jī)、勻漿器、研缽和研磨、壓榨器等。
1. 組織搗碎機(jī)
將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先撥至慢處，開(kāi)動(dòng)開(kāi)關(guān)后，逐步加速至所需速度。一般用于動(dòng)物組織、植物肉質(zhì)種子、柔嫩的葉芽等，轉(zhuǎn)速可高達(dá)10000rpm/M以上。由于旋轉(zhuǎn)刀片的機(jī)械切力很大,制備一些較大分子如核酸則很少使用。
2. 勻漿器
先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來(lái)回研磨，上下移動(dòng)，即可將細(xì)胞研碎。勻漿器的研缽磨球和玻璃管內(nèi)壁之間間隙保持在十分之幾毫米距離。制作勻漿器的材料，除玻璃外，還可以用硬質(zhì)塑料、不銹鋼、人造熒光樹(shù)脂等。此法細(xì)胞破碎程度比高速組織搗碎機(jī)為高，適用于量少和動(dòng)物臟器組織。
存在的問(wèn)題；較易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌，較小的革蘭氏陽(yáng)性首以及有些亞細(xì)胞器，質(zhì)地堅(jiān)硬，易損傷勻漿閥，也不適合用該法處理。
3. 研缽
多用于細(xì)菌或其他堅(jiān)硬植物材料，研磨時(shí)常加入少量石英砂，玻璃粉或其他研磨劑，以提高研磨效果。
4. 細(xì)菌磨
是一種改良了的研磨器，比研缽具有更大的研磨面積，而且低部有出口。操作時(shí)先把細(xì)菌和研磨粉調(diào)成糊狀，每次加入一小勺，研磨20-30秒即可將細(xì)菌細(xì)胞*磨碎。
物理法
主要通過(guò)各種物理因素使組織細(xì)胞破碎的方法。在生化制備中常用的方法有：
1. 反復(fù)凍溶法
原理：因突然冷凍，細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成及 胞內(nèi)外溶劑濃度的突然改變而破壞細(xì)胞。
方法：將待破碎的細(xì)胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。
特點(diǎn)：此法適用于組織細(xì)胞，多用于動(dòng)物性材料，對(duì)微生物細(xì)胞作用較差。
2. 急熱驟冷法
將材料投入沸水中，維持85-90分鐘，至水浴中急速冷卻，此法可用于細(xì)菌及病毒材料。
3. 超聲波處理
用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，頻高于15～20KHz的超聲波在高強(qiáng)度聲能輸入下可以進(jìn)行細(xì)胞破碎。其破碎機(jī)理：可能與空化現(xiàn)象引起的沖擊波和剪切力有關(guān)。超聲破碎的效率與聲頻、聲能、處理時(shí)間、細(xì)胞濃度及首種類(lèi)型等因素有關(guān)。
特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性較好，節(jié)省時(shí)間；多用于微生物和組織細(xì)胞的破碎。
存在問(wèn)題：超聲波破碎在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模應(yīng)用較普遍，處理少量樣品時(shí)操作簡(jiǎn)便，液量損失少，但是超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)能使某些敏感性活性物質(zhì)變性失活。而且大容量裝置聲能傳遞，散熱均有困難，應(yīng)采取相應(yīng)降溫措施。對(duì)超聲波敏感和核酸應(yīng)慎用?？栈饔檬羌?xì)胞破壞的直接原因，同時(shí)會(huì)產(chǎn)生活性氧，所以要加一些巰基保護(hù)劑。
化學(xué)及生物化學(xué)法
1. 自溶法
在一定PH和適當(dāng)?shù)臏囟认?，利用組織細(xì)胞內(nèi)自身的酶系統(tǒng)將。此過(guò)程需較長(zhǎng)時(shí)間，常用少量防腐劑如甲苯、等防止細(xì)胞的污染。
2. 酶溶法
利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶、半纖維素酶、脂酶等，將細(xì)胞壁分解，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來(lái)。有些細(xì)菌對(duì)溶菌酶不敏感，加入少量巰基試劑或8摩爾尿素處理后，使之轉(zhuǎn)為對(duì)溶菌酶敏感而溶解。
特點(diǎn)：
a） 此法適用多種微生物；
b） 具有作用條件溫和；
c） 內(nèi)含物成分不易受到破壞；
d） 細(xì)胞壁損壞的程度可以控制。
存在的問(wèn)題：易造成產(chǎn)物抑制作用，這可能是導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)釋放率低的一個(gè)重要因素。而且溶酶價(jià)格高，限制了大規(guī)模利用。若回收溶酶，則又增加百分離純化溶酶的操作。另外酶溶法通用性差，不同菌種需選擇不同的酶。有一定局限性，不適宜大量的蛋白質(zhì)提取，給進(jìn)一步純化帶來(lái)困難。
3. 化學(xué)滲透法
某些有機(jī)溶劑（如苯、甲苯）、抗生素、表面活性劑、金屬螯合劑、變性劑等化學(xué)藥品都可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性從而使內(nèi)合物有選擇地滲透出來(lái)。其作用機(jī)理；化學(xué)滲透取決于化學(xué)試劑的類(lèi)型以及細(xì)胞壁和膜的結(jié)構(gòu)與組成。
特點(diǎn)：多用于破碎細(xì)菌，且作用比較溫和；提取核酸時(shí)，常用此法破碎細(xì)胞。
存在的問(wèn)題：時(shí)間長(zhǎng)，效率低；化學(xué)試劑毒性較強(qiáng)，同時(shí)對(duì)產(chǎn)物也有毒害作用，進(jìn)一步分離時(shí)需要用透析等方法除去這些試劑；通用性差：某種試劑只能作用于某些特定類(lèi)型的微生物細(xì)胞。
小結(jié)
無(wú)論用哪一種方法破碎組織細(xì)胞，都會(huì)使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導(dǎo)致天然物質(zhì)量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，還可通過(guò)選擇pH、溫度或離子強(qiáng)度等，使這些條件都要適合于目的物質(zhì)的提取。
介紹的幾種，可謂各有千秋，在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)盡量考慮全面，選擇科學(xué)、有效的方法。|||順便提個(gè)問(wèn)題：
關(guān)于反復(fù)凍融有很多資料，但是都不夠詳細(xì)，想請(qǐng)教做過(guò)這方面的酷友們：
1、重懸緩沖液（裂解液？，PBS？）
2、凍溶溫度（液氮？，-20？，-80？）
3、解凍溫度（37？，40？）
4、反復(fù)次數(shù)（3 次以上？）反復(fù)凍融實(shí)際上與超聲波破碎或酶解一起使用，否則凍融后黏度很大，蛋白質(zhì)容易聚集，通常都是反復(fù)凍融后超聲波處理，這樣效果比較好<br />
你問(wèn)的幾個(gè)問(wèn)題其實(shí)都沒(méi)有具體答案，緩沖液，溫度等都與具體蛋白質(zhì)，具體實(shí)驗(yàn)要求有關(guān)，次數(shù)是基本達(dá)到你的要求即可
主要通過(guò)機(jī)械切力的作用使組織細(xì)胞破碎的方法，常用的器械有組織搗碎機(jī)、勻漿器、研缽和研磨、壓榨器等。
1. 組織搗碎機(jī)
將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先撥至慢處，開(kāi)動(dòng)開(kāi)關(guān)后，逐步加速至所需速度。一般用于動(dòng)物組織、植物肉質(zhì)種子、柔嫩的葉芽等，轉(zhuǎn)速可高達(dá)10000rpm/M以上。由于旋轉(zhuǎn)刀片的機(jī)械切力很大,制備一些較大分子如核酸則很少使用。
2. 勻漿器
先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來(lái)回研磨，上下移動(dòng)，即可將細(xì)胞研碎。勻漿器的研缽磨球和玻璃管內(nèi)壁之間間隙保持在十分之幾毫米距離。制作勻漿器的材料，除玻璃外，還可以用硬質(zhì)塑料、不銹鋼、人造熒光樹(shù)脂等。此法細(xì)胞破碎程度比高速組織搗碎機(jī)為高，適用于量少和動(dòng)物臟器組織。
存在的問(wèn)題；較易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌，較小的革蘭氏陽(yáng)性首以及有些亞細(xì)胞器，質(zhì)地堅(jiān)硬，易損傷勻漿閥，也不適合用該法處理。
3. 研缽
多用于細(xì)菌或其他堅(jiān)硬植物材料，研磨時(shí)常加入少量石英砂，玻璃粉或其他研磨劑，以提高研磨效果。
4. 細(xì)菌磨
是一種改良了的研磨器，比研缽具有更大的研磨面積，而且低部有出口。操作時(shí)先把細(xì)菌和研磨粉調(diào)成糊狀，每次加入一小勺，研磨20-30秒即可將細(xì)菌細(xì)胞*磨碎。
物理法
主要通過(guò)各種物理因素使組織細(xì)胞破碎的方法。在生化制備中常用的方法有：
1. 反復(fù)凍溶法
原理：因突然冷凍，細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成及 胞內(nèi)外溶劑濃度的突然改變而破壞細(xì)胞。
方法：將待破碎的細(xì)胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。
特點(diǎn)：此法適用于組織細(xì)胞，多用于動(dòng)物性材料，對(duì)微生物細(xì)胞作用較差。
2. 急熱驟冷法
將材料投入沸水中，維持85-90分鐘，至水浴中急速冷卻，此法可用于細(xì)菌及病毒材料。
3. 超聲波處理
用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，頻高于15～20KHz的超聲波在高強(qiáng)度聲能輸入下可以進(jìn)行細(xì)胞破碎。其破碎機(jī)理：可能與空化現(xiàn)象引起的沖擊波和剪切力有關(guān)。超聲破碎的效率與聲頻、聲能、處理時(shí)間、細(xì)胞濃度及首種類(lèi)型等因素有關(guān)。
特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性較好，節(jié)省時(shí)間；多用于微生物和組織細(xì)胞的破碎。
存在問(wèn)題：超聲波破碎在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模應(yīng)用較普遍，處理少量樣品時(shí)操作簡(jiǎn)便，液量損失少，但是超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)能使某些敏感性活性物質(zhì)變性失活。而且大容量裝置聲能傳遞，散熱均有困難，應(yīng)采取相應(yīng)降溫措施。對(duì)超聲波敏感和核酸應(yīng)慎用?？栈饔檬羌?xì)胞破壞的直接原因，同時(shí)會(huì)產(chǎn)生活性氧，所以要加一些巰基保護(hù)劑。
化學(xué)及生物化學(xué)法
1. 自溶法
在一定PH和適當(dāng)?shù)臏囟认?，利用組織細(xì)胞內(nèi)自身的酶系統(tǒng)將。此過(guò)程需較長(zhǎng)時(shí)間，常用少量防腐劑如甲苯、等防止細(xì)胞的污染。
2. 酶溶法
利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶、半纖維素酶、脂酶等，將細(xì)胞壁分解，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來(lái)。有些細(xì)菌對(duì)溶菌酶不敏感，加入少量巰基試劑或8摩爾尿素處理后，使之轉(zhuǎn)為對(duì)溶菌酶敏感而溶解。
特點(diǎn)：
a） 此法適用多種微生物；
b） 具有作用條件溫和；
c） 內(nèi)含物成分不易受到破壞；
d） 細(xì)胞壁損壞的程度可以控制。
存在的問(wèn)題：易造成產(chǎn)物抑制作用，這可能是導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)釋放率低的一個(gè)重要因素。而且溶酶價(jià)格高，限制了大規(guī)模利用。若回收溶酶，則又增加百分離純化溶酶的操作。另外酶溶法通用性差，不同菌種需選擇不同的酶。有一定局限性，不適宜大量的蛋白質(zhì)提取，給進(jìn)一步純化帶來(lái)困難。
3. 化學(xué)滲透法
某些有機(jī)溶劑（如苯、甲苯）、抗生素、表面活性劑、金屬螯合劑、變性劑等化學(xué)藥品都可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性從而使內(nèi)合物有選擇地滲透出來(lái)。其作用機(jī)理；化學(xué)滲透取決于化學(xué)試劑的類(lèi)型以及細(xì)胞壁和膜的結(jié)構(gòu)與組成。
特點(diǎn)：多用于破碎細(xì)菌，且作用比較溫和；提取核酸時(shí)，常用此法破碎細(xì)胞。
存在的問(wèn)題：時(shí)間長(zhǎng)，效率低；化學(xué)試劑毒性較強(qiáng)，同時(shí)對(duì)產(chǎn)物也有毒害作用，進(jìn)一步分離時(shí)需要用透析等方法除去這些試劑；通用性差：某種試劑只能作用于某些特定類(lèi)型的微生物細(xì)胞。
小結(jié)
無(wú)論用哪一種方法破碎組織細(xì)胞，都會(huì)使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導(dǎo)致天然物質(zhì)量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，還可通過(guò)選擇pH、溫度或離子強(qiáng)度等，使這些條件都要適合于目的物質(zhì)的提取。
介紹的幾種，可謂各有千秋，在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)盡量考慮全面，選擇科學(xué)、有效的方法。|||順便提個(gè)問(wèn)題：
關(guān)于反復(fù)凍融有很多資料，但是都不夠詳細(xì)，想請(qǐng)教做過(guò)這方面的酷友們：
1、重懸緩沖液（裂解液？，PBS？）
2、凍溶溫度（液氮？，-20？，-80？）
3、解凍溫度（37？，40？）
4、反復(fù)次數(shù)（3 次以上？）反復(fù)凍融實(shí)際上與超聲波破碎或酶解一起使用，否則凍融后黏度很大，蛋白質(zhì)容易聚集，通常都是反復(fù)凍融后超聲波處理，這樣效果比較好<br />
你問(wèn)的幾個(gè)問(wèn)題其實(shí)都沒(méi)有具體答案，緩沖液，溫度等都與具體蛋白質(zhì)，具體實(shí)驗(yàn)要求有關(guān)，次數(shù)是基本達(dá)到你的要求即可
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