腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子brain2derivedneurotro2phicfactor,BDNF）作為神經(jīng)生長因子家族成員,與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有著密切關(guān)系,不僅對中樞神經(jīng)元的發(fā)育、增殖分化、存活起重要作用,而且對損傷后神經(jīng)元的修復(fù)與功能重塑也起重要作用。BDNF廣泛分布于中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng),以海馬和皮質(zhì)含量zui高。研究表明BDNF可支持中腦多巴胺能神經(jīng)元存活并向多巴胺能表型分化,并且能保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元免受62羥多巴胺62OHDA的神經(jīng)毒素作用。還可通過支持膽堿能細(xì)胞的生存和上調(diào)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的表達(dá),增強(qiáng)神經(jīng)系統(tǒng)的學(xué)習(xí)記憶作用;可減少鈣離子內(nèi)流、抗自由基損傷、抑制細(xì)胞凋亡等,從而保護(hù)神經(jīng)元免受腦缺血缺氧的損傷。
由此可見,BDNF對多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如帕金森、癡呆及腦血管病等具有治療潛能,然而如何將其透過血腦屏障運(yùn)送至損傷的腦部,一直是十分困難的事情。1988年Green和Frankel各自獨(dú)立發(fā)現(xiàn)HIV21病毒上的反式激活因子transactivator,TAT）能夠進(jìn)入細(xì)胞膜,具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)作用Vives等研究發(fā)現(xiàn)TAT蛋白分子中與其在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的是1段富含堿性氨基酸、帶有較多正電荷的多肽片段核心序列由11個氨基酸即YGRKKRRQRRR組成。Schwarze等將TAT與相對分子質(zhì)量為15～200×10Da的蛋白進(jìn)行融合表達(dá)后,可介導(dǎo)這些蛋白從細(xì)胞外到細(xì)胞內(nèi)的。直接跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。1999年Schwarze[9]研究發(fā)現(xiàn)TAT能攜帶蛋白質(zhì)通過血腦屏障,積累到一定濃度并表現(xiàn)出蛋白活性。TAT具有速度快,不依賴于溫度、能量、細(xì)胞膜抗體,對細(xì)胞沒有損傷等特點(diǎn),因此被認(rèn)為是一種很有前途的運(yùn)載工具。本研究通過克隆人BDNF基因,構(gòu)建含有TAT2BDNF的重組表達(dá)載體,為進(jìn)一步表達(dá)融合蛋白及探討TAT攜帶BDNF穿透血腦屏障治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病奠定基礎(chǔ)。
1　材料與方法
1.1　材料　①菌株和質(zhì)粒:含蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的pTAT/HA表達(dá)質(zhì)粒,由美國華盛頓大學(xué)Dowdy教授惠贈,見圖1;感受態(tài)細(xì)胞DH為本實(shí)驗(yàn)室保存。②主要材料和試劑:5月齡引產(chǎn)胎兒的胚胎腦組織,液氮中保存;總RNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒及小量質(zhì)粒提取試劑盒購于QIAGEN公司,OligodT、XhoⅠ、EcoRⅠ購于Promega公司,凝膠圖像分析儀購于美國syugene公司,MarkerDL2000購于上海生工生物工程公司,BD2NF的引物合成及DNA測序由上海生工公司完成。③PCR引物設(shè)計:參照GenBank人BDNF全基因序列,應(yīng)用Omiga基因分析軟件分別設(shè)計內(nèi)側(cè)和外側(cè)引物。
1.2　方法　
1.2.1　胚胎腦組織的提取　秤取5月齡引產(chǎn)胎兒的腦組織100mg,按照總RNA提取試劑盒說明書提取腦組織總RNA,測定A（260nm）/A（280nm）比值及RNA濃度。
1.2.2　BDNF目的基因的擴(kuò)增?、賑DNA的制備:以O(shè)ligodT為逆轉(zhuǎn)錄引物,以提取的總RNA為模板,在AMV反轉(zhuǎn)錄酶催化下獲得含有目的基因的cDNA,反應(yīng)條件為42℃水浴45min,72℃水浴5min。②巢式PCR擴(kuò)增:第1輪PCR以cDNA為模板,采用外側(cè)引物擴(kuò)增含目的基因的大片斷,反應(yīng)μ體積為30L,反應(yīng)條件為94℃變性5min,52℃退火45s,72℃延伸1min,共35個反應(yīng)循環(huán),zui后72℃延伸5min,反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將鑒定為陽性的第1輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍后作為模板,采用內(nèi)側(cè)引物擴(kuò)增特異目的基因,反應(yīng)體積為30L,反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min,55℃退火45s,72℃延伸5min,共25個反應(yīng)循環(huán),zui后72℃延伸5min,第2輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物亦經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
1.2.3　pTAT/HA2BDNF質(zhì)粒的構(gòu)建　pTAT/HA載體及經(jīng)純化回收的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別用XhoI/EcoRI核酸內(nèi)切酶雙酶切后,經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,割膠回收線性載體及BDNF片段,加入T4連接酶反應(yīng)體系,4℃連接16h,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH,37℃恒溫培養(yǎng)14h后,挑取陽性克隆,提取質(zhì)粒,用XhoI/EcoRI酶切,1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,選取正確的重組質(zhì)粒載體測序。