細胞凍存
0、概要
     細胞培養(yǎng)的傳代及日常維持過程中，在培養(yǎng)器具、培養(yǎng)液及各種準(zhǔn)備工作方面都需大量的耗費，而且細胞一旦離開活體開始原代培養(yǎng)，它的各種生物特性都將逐漸發(fā)生變化并隨著傳代次數(shù)的增加和體外環(huán)境條件的變化而不斷有新的變化。因此及時進行細胞凍存十分必要。細胞冷凍儲存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；細胞儲存在液氮中，溫度達-196℃，理論上儲存時間是無限的。
一、細胞凍存原理
        細胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實驗證明這樣可以zui大限度的保存細胞活力。目前細胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質(zhì)能提高細胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外，減少細胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。
二、低溫凍存細胞步驟
1.用于凍存的細胞必須是健康無污染的，并且在凍存之前必須在對數(shù)生長期生長幾天。
2.培養(yǎng)貼壁細胞到對數(shù)生長期的末期，胰酶消化后離心。如果凍存的是懸浮細胞，則只要離心即可。
3.用無菌的含血清的、同時含有10%（v/v）二甲亞砜（DMSO）的培養(yǎng)基重懸細胞。操作一定要快，盡量減少細胞暴露在液體DMSO中的時間。要使用zui高純度的DMSO，是使用之前未開封或長期暴露于光線下的DMSO。
4.將適當(dāng)體積和數(shù)量的細胞加入凍存管──通常一毫升的凍存管加入2×105至 5×106個細胞?？梢允褂盟芰匣虿ＡУ膬龃婀?。但是外部有硅樹脂密封的塑料凍存管在高于液氮溫度下使用效果（如液氮的蒸汽相）。浸沒到液氮的液相中會導(dǎo)致液氮進入凍存管，在化凍過程中可能導(dǎo)致凍存管內(nèi)容物噴出。如果儲存在液氮中，則內(nèi)部帶有O形密封環(huán)的塑料凍存管效果更好。玻璃凍存管由于其安全密封和其內(nèi)容物化凍快速的特點，能夠保證較高的細胞活力，在使用時效果。但是由于它們在使用時需要火焰密封而顯得不夠方便。
5.將凍存管放在能夠控制降溫速率的冷凍器中，以1℃/分鐘的速度進行冷卻。如果沒有可控降溫速率的冷凍器，還可以通過以下的方法獲得滿意的結(jié)果：
a.將凍存管放在一個1英寸厚的泡沫塑料絕熱盒子中，然后于-70℃放置12小時。
b.在液氮罐中用液氮的蒸汽相冷卻凍存管。
c.把凍存管放在盛滿異丙醇的容器中，然后放入-70℃冰箱。
d.直接把凍存管在-20°C放幾個小時，然后轉(zhuǎn)移到-70°C進一步冷卻。
e.直接把凍存管放入-70°C冰箱。zui后兩種方法（d和e）不是很理想，因為細胞活力會受到影響，一些敏感的細胞種群可能會丟失。這些方法只有在沒有其他選擇的時候才可以采用。
6.冷凍之后，凍存管應(yīng)該轉(zhuǎn)移到充滿液氮的容器中。在-135°C以上保存過長的時間會降低細胞的活力。