細(xì)胞凍存
0、概要
     細(xì)胞培養(yǎng)的傳代及日常維持過(guò)程中，在培養(yǎng)器具、培養(yǎng)液及各種準(zhǔn)備工作方面都需大量的耗費(fèi)，而且細(xì)胞一旦離開活體開始原代培養(yǎng)，它的各種生物特性都將逐漸發(fā)生變化并隨著傳代次數(shù)的增加和體外環(huán)境條件的變化而不斷有新的變化。因此及時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存十分必要。細(xì)胞冷凍儲(chǔ)存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；細(xì)胞儲(chǔ)存在液氮中，溫度達(dá)-196℃，理論上儲(chǔ)存時(shí)間是無(wú)限的。
一、細(xì)胞凍存原理
        細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實(shí)驗(yàn)證明這樣可以zui大限度的保存細(xì)胞活力。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。
二、低溫凍存細(xì)胞步驟
1.用于凍存的細(xì)胞必須是健康無(wú)污染的，并且在凍存之前必須在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)幾天。
2.培養(yǎng)貼壁細(xì)胞到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的末期，胰酶消化后離心。如果凍存的是懸浮細(xì)胞，則只要離心即可。
3.用無(wú)菌的含血清的、同時(shí)含有10%（v/v）二甲亞砜（DMSO）的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。操作一定要快，盡量減少細(xì)胞暴露在液體DMSO中的時(shí)間。要使用zui高純度的DMSO，是使用之前未開封或長(zhǎng)期暴露于光線下的DMSO。
4.將適當(dāng)體積和數(shù)量的細(xì)胞加入凍存管──通常一毫升的凍存管加入2×105至 5×106個(gè)細(xì)胞。可以使用塑料或玻璃的凍存管。但是外部有硅樹脂密封的塑料凍存管在高于液氮溫度下使用效果（如液氮的蒸汽相）。浸沒到液氮的液相中會(huì)導(dǎo)致液氮進(jìn)入凍存管，在化凍過(guò)程中可能導(dǎo)致凍存管內(nèi)容物噴出。如果儲(chǔ)存在液氮中，則內(nèi)部帶有O形密封環(huán)的塑料凍存管效果更好。玻璃凍存管由于其安全密封和其內(nèi)容物化凍快速的特點(diǎn)，能夠保證較高的細(xì)胞活力，在使用時(shí)效果。但是由于它們?cè)谑褂脮r(shí)需要火焰密封而顯得不夠方便。
5.將凍存管放在能夠控制降溫速率的冷凍器中，以1℃/分鐘的速度進(jìn)行冷卻。如果沒有可控降溫速率的冷凍器，還可以通過(guò)以下的方法獲得滿意的結(jié)果：
a.將凍存管放在一個(gè)1英寸厚的泡沫塑料絕熱盒子中，然后于-70℃放置12小時(shí)。
b.在液氮罐中用液氮的蒸汽相冷卻凍存管。
c.把凍存管放在盛滿異丙醇的容器中，然后放入-70℃冰箱。
d.直接把凍存管在-20°C放幾個(gè)小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到-70°C進(jìn)一步冷卻。
e.直接把凍存管放入-70°C冰箱。zui后兩種方法（d和e）不是很理想，因?yàn)榧?xì)胞活力會(huì)受到影響，一些敏感的細(xì)胞種群可能會(huì)丟失。這些方法只有在沒有其他選擇的時(shí)候才可以采用。
6.冷凍之后，凍存管應(yīng)該轉(zhuǎn)移到充滿液氮的容器中。在-135°C以上保存過(guò)長(zhǎng)的時(shí)間會(huì)降低細(xì)胞的活力。