摘要：

近年來(lái)，流式細(xì)胞分選和激光捕獲顯微切割技術(shù)的出現(xiàn)讓單細(xì)胞的捕獲成為可能。不過(guò)，在獲得目的細(xì)胞之后，如何與下游分析技術(shù)（如新一代測(cè)序和芯片）銜接呢？單個(gè)細(xì)胞只含有pg級(jí)的DNA，細(xì)菌更是只有fg級(jí)的DNA，但測(cè)序或芯片分析通常需要μg甚至mg級(jí)的DNA。怎么辦？讓全基因組擴(kuò)增來(lái)幫忙！

在細(xì)胞分析中，我們往往采用細(xì)胞群體，來(lái)獲取某個(gè)參數(shù)的平均值。然而，隨著細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，我們逐漸意識(shí)到，平均值已不再能滿足我們的要求。對(duì)于一些復(fù)雜的組織，群體性研究只能獲得某些數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)的細(xì)胞信息，比如高度異質(zhì)性的實(shí)體瘤組織。同時(shí)，還有一些細(xì)胞的量極少，如產(chǎn)前診斷中的胎兒細(xì)胞或循環(huán)腫瘤細(xì)胞。當(dāng)然，別忘了自然界還存在各種各樣的微生物。其中，大部分微生物不僅數(shù)量有限，也無(wú)法用傳統(tǒng)的方法擴(kuò)大培養(yǎng)。對(duì)于這些微量細(xì)胞的分析，常規(guī)的技術(shù)顯然束手無(wú)策。

全基因組擴(kuò)增（whole gemome amplification）是對(duì)全部基因組序列進(jìn)行非選擇性擴(kuò)增的技術(shù)，其目的是在沒有序列偏向性的前提下大幅度增加DNA的總量。之前人們常用基于PCR的擴(kuò)增方法（如DOP-PCR和PEP-PCR），但這些方法不能對(duì)各個(gè)片段進(jìn)行均勻地?cái)U(kuò)增，有可能產(chǎn)生擴(kuò)增假象。因此，目前人們多采用多重置換擴(kuò)增（MDA）方法。

號(hào)稱基因組復(fù)印機(jī)的QIAGEN REPLI-g試劑盒正是基于多重置換擴(kuò)增技術(shù)，對(duì)有限的樣品進(jìn)行快速、均勻、無(wú)偏向的等溫全基因組擴(kuò)增，從而獲得更多遺傳信息。原理是什么？請(qǐng)看圖1。

圖1. 多重置換擴(kuò)增（MDA）技術(shù)

在擴(kuò)增過(guò)程中，引物與模板DNA 退火，并利用在DNA 模板鏈上移動(dòng)的Phi 29 聚合酶在30°C 延伸，取代互補(bǔ)鏈，同時(shí)自身成為復(fù)制的模板。與PCR 擴(kuò)增不同，MDA 不需要不同的溫度，且zui終的片段非常長(zhǎng)（2-70 kb），突變率低。

之前QIAGEN已有多款REPLI-g試劑盒，而新品REPLI-g Single Cell Kit則是專為單細(xì)胞研究人員而設(shè)計(jì)的。與之前的試劑盒相比，它有兩點(diǎn)不同：采用優(yōu)化配方的高保真Phi 29 聚合酶；增加了UV去污染步驟。

REPLI-g sc 聚合酶是高保真Phi 29 聚合酶的優(yōu)化配方，具有強(qiáng)的置換活性，可通過(guò)多重置換擴(kuò)增（MDA）擴(kuò)增復(fù)雜的基因組DNA，而溫和的堿變性步驟可防止DNA 片段化并產(chǎn)生脫堿基位點(diǎn)。Phi 29 聚合酶確保了基因座的均勻擴(kuò)增，它zui多能復(fù)制70 kb 而不與基因組DNA 模板解離，實(shí)現(xiàn)了基因座的均勻擴(kuò)增。Phi 29 聚合酶有著3’ → 5’ 的核酸外切酶校正活性，在復(fù)制時(shí)其保真度比Taq DNA 聚合酶高出1000 倍，從而避免了擴(kuò)增偏向或突變。相比之下，那些基于PCR的擴(kuò)增方法會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增片段短且容易出錯(cuò)，帶來(lái)單堿基對(duì)突變、STR縮小和擴(kuò)大。

同時(shí)，REPLI-g Single Cell Kit 使用專門的緩沖液和試劑，反應(yīng)設(shè)置相當(dāng)簡(jiǎn)單，且處理時(shí)間僅為15 分鐘。這些*的組分，再加上標(biāo)準(zhǔn)化的UV 處理步驟，能夠消除任何可檢測(cè)到的殘留DNA污染，確保高質(zhì)量結(jié)果僅僅來(lái)自您那個(gè)寶貴的細(xì)胞。此試劑盒也可使用已純化的基因組DNA、新鮮或干燥的血液，以及新鮮或冷凍的組織。

表1. REPLI-g Single Cell Kit的組分

這下，哪怕只有一個(gè)細(xì)胞在手，您也可以大膽地開展各種下游分析了吧。經(jīng)REPLI-g Single Cell擴(kuò)增后，DNA產(chǎn)物平均長(zhǎng)度超過(guò)10 kb，產(chǎn)量高達(dá)40 μg，且完整覆蓋基因組，高度適合也已經(jīng)開發(fā)用于新一代測(cè)序（NGS）、芯片法比較基因組雜交（array CGH）或qPCR分析。

圖2. 完整的基因組覆蓋。利用RT2 qPCR Primer Assays（QIAGEN）以及REPLI-g Single Cell Kit 在3 個(gè)不同的單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中擴(kuò)增DNA 后開展實(shí)時(shí)定量PCR，對(duì)整個(gè)人類基因組中分布在不同染色體上的267 個(gè)基因座進(jìn)行全面分析。低且一致的CT 值、無(wú)任何標(biāo)記的丟失，表明基因組中所有區(qū)域的成功擴(kuò)增，高度適合單細(xì)胞基因組學(xué)。

當(dāng)然，事實(shí)勝于雄辯。東西好不好，用過(guò)了才有發(fā)言權(quán)。好吧，現(xiàn)在請(qǐng)客戶來(lái)發(fā)言。

*位是華大基因研究員宋盧挺。他之前一直用REPLI-g mini kit，這一次評(píng)估了REPLI-g Single Cell Kit。他選用正常的淋巴細(xì)胞系樣品，分別做了1個(gè)無(wú)擴(kuò)增的大量細(xì)胞（>1000000個(gè)）、1個(gè)Qiagen REPLI-g single cell kit單細(xì)胞、3個(gè)Qiagen REPLI-g mini kit單細(xì)胞、1個(gè)Qiagen REPLI-g mini kit多細(xì)胞（約15細(xì)胞）樣品的約0.5x全基因組測(cè)序。

他認(rèn)為，相對(duì)于原REPLI-g mini kit，新的single cell kit可極大地降低擴(kuò)增偏向性，實(shí)現(xiàn)全基因組較均一的擴(kuò)增（接近無(wú)擴(kuò)增的效果），使此試劑盒產(chǎn)物有了同時(shí)可檢測(cè)SNP和CNV、SV的可能性。但在Mean Mapping Quality、Read mapping ratio、Read duplicated ratio等數(shù)據(jù)方面，因原REPLI-g mini kit效果已較好，無(wú)變化。

第二位是新加坡基因組研究院的Masafumi Muratani 博士。他談道：“我已經(jīng)試過(guò)了這個(gè)試劑盒，并成功開展了單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增。所獲得的DNA 讓我能可靠檢測(cè)一個(gè)結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系中等位基因特異的點(diǎn)突變。擴(kuò)增后DNA 的出色產(chǎn)量和序列代表性確實(shí)幫助我推進(jìn)了單細(xì)胞基因組學(xué)的研究工作。”

有了身邊這兩位研究人員的現(xiàn)身說(shuō)法，現(xiàn)在您應(yīng)該充滿信心了吧。如果您恰好在從事癌癥研究或宏基因組學(xué)研究，那么不妨試試這個(gè)新產(chǎn)品。