一、基因組DNA提取

實驗?zāi)康?/p>

基因組DNA的制備是基因分析的前提。 本實驗要求掌握基因組DNA提取的基本方法。實驗原理 DNA在生物體內(nèi)是與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物的形式存在的。核酸與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合力包括離子鍵、氫鍵、范德華力等，破壞或降低這些結(jié)合力就可把核酸與蛋白分開。 DNA、RNA所含有的嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)的共軛雙鍵具有吸收紫外光的性質(zhì)，吸收高峰在260nm處，所以，可用紫外分光光度法測定DNA的濃度。

基因組DNA提取試劑盒：

在高鹽的狀態(tài)下，DNA純化樹脂專一性地吸附DNA；而在低鹽或水溶液狀態(tài)下，DNA被洗脫下來。

器材與試劑

臺式高速離心機、天平、水浴恒溫箱、移液槍、塑料離心管等 試劑盒（純化樹脂、GN結(jié)合液、漂洗液、無水乙醇、離心純化柱）、TE緩沖液操作

1、將全血輕輕混勻，轉(zhuǎn)移0.5ml全血到1ml純化樹脂中，顛倒混勻5-6次，室溫，3min。其間要顛倒混勻1次，5000r/min離心×3sec；

2、取沉淀，加1mlGN結(jié)合液懸浮沉淀，顛倒混勻，5000r/min離心×3sec；

3、取沉淀，加0.5ml漂洗液純化樹脂2次，顛倒混勻，5000r/min離心×3ecs；

4、取沉淀，加0.8ml無水乙醇懸浮沉淀，顛倒混勻；裝入離心純化柱，12000r/min離心×1min，棄乙醇液；

5、空柱再12000r/min離心×1min，進一步棄乙醇液；

6、取離心好的純化柱套入一干凈的1.5ml離心管中，加入100ulTE緩沖液于純化樹脂上（不能粘在管壁上），室溫下放置3min，12000r/min離心×2min。注意事項 一般情況下，純凈的DNAOD260/OD280比值約為1.8，RNA為2.0。若樣品中含蛋白質(zhì)，則比值下降，必要時需重新抽提。若DNA的比值<1.75，則加入SDS至0.5%； 從核酸中去除蛋白質(zhì)時，常用到酚：氯仿等體積混合液。氯仿的作用是使蛋白質(zhì)變性并有助于水相和有機相的分離； DNA用TE溶解，可增加DNA的穩(wěn)定性，便于長期保存。

二、PCR擴增技術(shù)

實驗?zāi)康?/p>

本實驗以所提出的全血基因組DNA為模板，以線粒體基因上一段核苷酸為引物，擴增出924bp的擴增產(chǎn)物。學(xué)習(xí)并掌握PCR反應(yīng)的基本原理與實驗技術(shù)。實驗原理 多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)的原理類似于DNA的天然復(fù)制過程。

可簡述為： 在微量離心管中加入適量緩沖液，加入微量模板DNA，四種脫氧核苷酸（dNTP），和耐熱Taq聚合酶及兩個合成的DNA引物，并有Mg2+存在。 加熱使模板DNA在高溫下（94℃）變性，雙鏈解鏈，這是所謂變性階段。 降低溶液溫度，使合成引物在低溫（56℃）與模板DNA互補退火形成部分雙鏈，這是所謂退火階段。 溶液反應(yīng)溫度升至中溫（72℃），在Taq酶作用下，以四種dNTP為原料，引物為復(fù)制起點，模板DNA的一條雙鏈在解鏈和退火之后延伸為兩條雙鏈，這是延伸階段。

如此反復(fù)，在同一反應(yīng)體系中可重復(fù)高溫變性、低溫復(fù)性和DNA合成這一循環(huán)，使產(chǎn)物DNA重復(fù)合成，并且在重復(fù)過程中，前一循環(huán)的產(chǎn)物DNA可作為后一循環(huán)的模板DNA而參與DNA的合成，使產(chǎn)物DNA的量按2n方式擴增。經(jīng)過25～35個循環(huán)，DNA擴增倍數(shù)可達106～109。

器材和試劑

器材 PCR擴增儀，旋渦振蕩器，臺式離心機，加樣槍及槍頭等試劑

1、藍色管：TaqDNA聚合酶、dNTP、Mg＋＋等

2、黃色管：引物1（68kb上游）、引物2（69kb下游）

3、白色管：無菌ddH2O

4、模板DNA：為本次實驗所提出的全血基因組DNA操作 無菌ddH2O21.5ulTaq酶等25ul引物1（68）0.6ul引物2（69）0.9ul模板DNA2ul 混勻后，離心5000r/min×1min，置PCR儀PCR擴增的設(shè)定： 設(shè)置PCR擴增儀的熱蓋溫度為100℃預(yù)變性：94℃5min循環(huán)：94℃變性30s 56℃退火30s30個循環(huán)72℃延伸30s 末次延伸：72℃5min4℃保存

注意事項

1.由于PCR技術(shù)非常敏感，可使一個DNA分子得以擴增，裝有PCR試劑的微量離心管打開之 前，應(yīng)先在微量離心機上作瞬時離心使液體沉積于管底。

2.在加完所有其它反應(yīng)成分后才加模板DNA，加模板DNA時不要形成噴霧。

3.若用沒有熱蓋的PCR擴增儀，則需在反應(yīng)體系中加入液體石蠟等礦物油封閉體系以防止反應(yīng) 過程中液體的蒸發(fā)。