亞克隆：細胞克隆中，對培養(yǎng)的細胞來說，從原有的克隆中，再篩選出具有某種特性的細胞進行培養(yǎng)，就是subclone，分為細胞克隆和分子克隆。

一、亞克隆實驗目的

1、掌握細菌基因組提取的方法和原理。

2、掌握限制性核酸內(nèi)切酶處理基因組及其結(jié)果分析。

3、掌握基因片段回收的方法。

二、亞克隆實驗原理

    細菌基因組的提取：通過堿法或者酶法裂解細菌之后，可以將胞內(nèi)的核酸和蛋白質(zhì)全釋放出來。DNA溶于1mol/L的NaCl中，不溶于0.14mol/L的NaCl，而RNA溶于0.14mol/L的NaCl不溶于1mol/L的NaCl中，通過溶液中鹽濃度的變化可以將DNA和RNA分開。氯仿－異戊醇法除去蛋白，2倍體積乙醇將DNA沉淀出來。

    限制性核酸內(nèi)切酶只作用于特定的位點，處理基因組后只會得到有限的片斷。通過單酶切或者多酶切后電泳檢驗就可以得到與物種本身有關的特定的圖譜。

    電泳后選定目的基因的條帶，紫外燈下將含有目的基因的凝膠切下，使用凝膠回收試劑盒，將凝膠溶化后，通過吸附柱時，核酸片段就吸附在柱上，洗脫液洗脫后加入2倍體積乙醇，核酸沉淀，TE溶解沉淀，核酸片段得到回收。

三、試劑與器材

1、試劑 E.coli JM109，牛肉膏，胰蛋白胨，NaCl，微量細菌基因組抽提試劑盒（上海生工），BamH I、Xho1 核酸內(nèi)切酶（Takara），NEB 標準分子量片段（1kb DNA Ladder），凝膠電泳回收試劑盒

2、器材 高速臺式冷凍離心機，水平電泳儀，漩渦混合儀，紫外檢測儀，凝膠成像分析系統(tǒng)，微量移液器及吸頭。

四、操作方法

1．使用LB培養(yǎng)基活化、培養(yǎng)菌體。

2．離心收集菌體，根據(jù)試劑盒說明提取基因組。

3．限制性酶處理基因組。

4．E.coli JM109的基因組經(jīng)過限制性內(nèi)切酶處理后，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)將酶切圖譜采集下來并對其分析。

5．紫外燈下將需要回收的核酸片段切下來，使用凝膠回收試劑盒回收DNA片段。

6．電泳檢測回收的核酸片段。

五、關鍵步驟與注意事項

1．菌體培養(yǎng)過程要嚴格無菌，染菌后提取得到的基因組會成多條帶，酶切的圖譜也會比較復雜。

2．基因組提取過程中所使用的器材要嚴格滅菌，防止核酸酶降解基因組。

3．基因組提取過程不可以劇烈振蕩，防止DNA斷鏈。

4．在內(nèi)切酶zui適條件下充分處理基因組，得到正確的圖譜。

5．瓊脂糖溶化要充分。

6．切下凝膠時要注意防護紫外線，電泳結(jié)束之后盡快將膠條切下來，凝膠條要窄，脫尾部分不回收。