ELIS試劑盒技術(shù)優(yōu)勢及應(yīng)用  
     ELIS試劑盒的歷史可以追溯到1963年Jerne等人創(chuàng)立的溶血空斑技術(shù)（hemo-lytic plaque forming cell assay，HPF），這項技術(shù)可用于檢測并計數(shù)單個抗體形成細(xì)胞。隨著單克隆抗體技術(shù)的成熟，1983年，Czerkinsky等采用此法檢測脾細(xì)胞中分泌特異性抗體的細(xì)胞數(shù)，發(fā)現(xiàn)該方法敏感性高簡便易行。后來，他們又用這種方法定量分析受到有絲分裂原刺激的外周血中分泌IFN2γ的細(xì)胞數(shù)。隨后，用ELISPOT法在單細(xì)胞水平檢測分泌其他細(xì)胞因子（如IL-2，IL-4，IL-5，IL-10，TNFα和IL-6） 數(shù)量的手段也被建立起來。Nordstrom等用生物素-抗生物素蛋白生物放大法來提高這種方法的敏感性，Herr用計算機(jī)輔助圖像分析系統(tǒng)（computer-assisted video image analysis，CVIA）自動分析TNF2α酶聯(lián)免疫斑點的大小和數(shù)量，計算與負(fù)載抗原肽的靶細(xì)胞接觸后外周血單核細(xì)胞（PBMC）中抗原特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)量，不但提高了對背景染色的分辨力也使大規(guī)模研究成為可能。Vaquerano等將數(shù)碼相機(jī)和計算機(jī)結(jié)合起來，開發(fā)出類似的斑點計數(shù)系統(tǒng)，認(rèn)為當(dāng)每孔斑點數(shù)大于100時，這種方法更客觀、可重復(fù)性高且節(jié)省時間。  
       隨著ELIS試劑盒技術(shù)的不斷發(fā)展，它的優(yōu)勢也漸漸顯示出來，下面將列舉ELISPOT對比其它一些傳統(tǒng)技術(shù)的優(yōu)勢所在。  
      ELIS試劑盒 分析使單細(xì)胞分泌產(chǎn)物可視化。這些分析異常敏感，因為它是在直接在分泌細(xì)胞的周圍進(jìn)行捕捉，而且是在表面被沖淡，或者被臨近的細(xì)胞上的受體捕獲，或降解之前。zui低至1：100萬細(xì)胞精度的活體外頻率測量。這種分辨率已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過使用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的四聚物染色和ELISA法測量的精度。這種高敏感度是非常關(guān)鍵的，因為抗原特異性 T 細(xì)胞在體外都是典型性的低頻率。高產(chǎn)量T細(xì)胞分析成為可行。一個經(jīng)過訓(xùn)練的相關(guān)實驗室小組可以測試成百的樣本中幾十種抗原的反應(yīng)。只需要少量細(xì)胞，就可以用于通其他細(xì)胞學(xué)分析方法進(jìn)行比較。例如，45毫升的血液就足以用于測試600種不同抗原/肽類物質(zhì)的反應(yīng)。可以定義CD4和CD8細(xì)胞的免疫因子指標(biāo)。這是因為只需要少數(shù)細(xì)胞，分析就可以在高產(chǎn)量模式下進(jìn)行。ELISPOT分析在篩選肽庫，繪制免疫因子方面是一個理想的工具。 用于確定抗原特異性T細(xì)胞的功能性親和力。這zui大可能受到肽類藥物刺激至50%的影響。可以用于研究未經(jīng)藥物處理過的細(xì)胞的分泌過程。如果觀察到凈產(chǎn)量減少，可以確定這種區(qū)別是來自分泌細(xì)胞的減少，還是每個細(xì)胞分泌產(chǎn)量的減少。淋巴細(xì)胞在ELISPOT分析后依然存活。這使得分析之后進(jìn)行增值，用于更進(jìn)一步的分析、克隆或者低溫儲藏成為可能低溫儲藏后的人類淋巴細(xì)胞可以用于檢測，而不會丟失其功能。治療前和治療后的樣本可以并排進(jìn)行測試，結(jié)果可以重復(fù)。  
（1） 與ELIS試劑盒  
       ELIS試劑盒 通過顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得出可溶性蛋白總量。ELISPOT 也是通過顯色反應(yīng)，在細(xì)胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點，可直接在顯微鏡下人工計數(shù)斑點或通過計算機(jī)輔助的分析系統(tǒng)對斑點進(jìn)行計數(shù)， 1個斑點代表1個細(xì)胞，從而計算出分泌該蛋白的細(xì)胞的頻率。（某些研究不僅要測細(xì)胞因子生成量，還需檢測分泌此細(xì)胞因子的細(xì)胞頻率）由于是單細(xì)胞水平檢測，ELISPOT比ELISA更靈敏，能從20萬-30萬細(xì)胞中檢出1個分泌該蛋白的細(xì)胞。捕獲抗體具有高親和力、高特異性、低內(nèi)毒素的單抗，在研究者以刺激劑激活細(xì)胞時，不會影響活化細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。   
與有限稀釋法（limiting dilution analysis，LDA）  
       LDA能夠?qū)μ禺愋?/span>CTL細(xì)胞進(jìn)行定量，曾在很多年中被認(rèn)為是CTL 檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，它使人們能夠詳細(xì)了解免疫反應(yīng)動力學(xué)和記憶毒性T淋巴細(xì)胞（memorial CTL， mCTL） 亞群的細(xì)胞周期。但該方法需要高強(qiáng)度抗原刺激， 這會加快效應(yīng)CTL（eCTL）凋亡，且不能定量測定eCTL細(xì)胞數(shù)量或測定值偏低。其次，該方法較繁瑣，培養(yǎng)時間可長達(dá)2～3周，而且很容易造成T細(xì)胞數(shù)量損失。  
（2） 與四聚體法（Tetramer）  
       zui近幾年出現(xiàn)了MHC2Ⅰ類分子抗原肽四聚體法。該法的優(yōu)勢在于迅速、直接、靈敏且特異性強(qiáng)，即使當(dāng)體內(nèi)mCTL水平低于1%，用MHC2Ⅰ抗原肽四聚體法仍可直接測到準(zhǔn)確的值，比LDA 敏感度要高5～10倍。但該技術(shù)也存在較多應(yīng)用上的困難：除了合成及穩(wěn)定MHCⅠ類分子的技術(shù)困難外，zui主要缺點是表位的選擇。由于每次反應(yīng)只能分析單一的抗原表位，而MHCⅠ類分子結(jié)合的各種表位，能否形成CTL反應(yīng)，卻隨著基因背景及時間的變化而變化，因此選擇正確的表位就顯得尤為重要。優(yōu)勢表位的篩選可以通過Elispot 來進(jìn)行，但對整個肽庫進(jìn)行掃描，并不是一件很容易的事。當(dāng)然，生物信息學(xué)的運(yùn)用對表位的篩選有很大的幫助。同時，有研究結(jié)果表明，并非所有經(jīng)過Tetramer 鑒定的陽性細(xì)胞都有確切的功能， Tetramer陽性的細(xì)胞數(shù)是用ELISPOT分析能分泌INF2γ細(xì)胞數(shù)的10倍，其中很多是不表現(xiàn)功能的惰性細(xì)胞，可能代表了記憶型CTL前體細(xì)胞。Tetramer分析只增加了分析的靈敏度，同時測定其功能很重要。  
（3） 與Cr51釋放法  
       此法是一種比較經(jīng)典的方法，雖然在檢測CTL識別的抗原多樣性方面非常有效，且能闡明被CTL識別的*表位，但至多為半定量的層面，而且Cr51標(biāo)記細(xì)胞的自發(fā)釋放率較高，不適于較長時間培養(yǎng)；標(biāo)記時所需的細(xì)胞濃度較高，因而給試驗帶來諸多不便；此外，Cr51釋放法所測定的是一個細(xì)胞群體的特性，而不是單個細(xì)胞。  
（4） 與胞內(nèi)CK染色法  
       與ELISPOT法相比較，胞內(nèi)CK染色法（intra-cellular CK staining，ICS） 主要應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)累積細(xì)胞因子的染色和多色參數(shù)的FACS法，是檢測循環(huán)淋巴細(xì)胞中抗原特異性T 淋巴細(xì)胞的可行方法，而ELISPOT法卻可以檢測所有分泌CK的eCTL 。  

應(yīng)用  
       目前，ELISPOT已被用于檢測藥物、化學(xué)制劑及其它CK復(fù)合物的特性及功能等方面，因此為體內(nèi)免疫功能的調(diào)節(jié)效應(yīng)提供了檢測依據(jù)。近幾年來， ELISPOT技術(shù)在腫瘤疫苗評價試驗、免疫監(jiān)測及免疫學(xué)研究中越來越被廣泛地使用。  

（1） 在抗腫瘤免疫及相關(guān)領(lǐng)域中的應(yīng)用  
      在許多研究中，該技術(shù)已被用于免疫動物外周血淋巴細(xì)胞中抗原特異的細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）的數(shù)量檢測。近期，ELISPOT技術(shù)已用于分析和評價從傳染病病人的PBMC中檢測肽特異的T淋巴細(xì)胞以及在癌癥病人中誘導(dǎo)腫瘤特異的T細(xì)胞的疫苗試驗。  
ELISPOT檢測T細(xì)胞反應(yīng)時敏感性、特異性和可重復(fù)性都很高，操作簡單迅速，需要少量標(biāo)本，在檢測抗原特異性細(xì)胞數(shù)量的同時也反應(yīng)其功能，并與臨床結(jié)果相關(guān)。ELISPOT平板可以提前大量準(zhǔn)備，移液、洗板和讀板都可自動化，因而大批量檢查也可做到快速。在與與其他方法的比較后，ELISPOT很可能成為定量分析腫瘤或病毒特異性的T細(xì)胞反應(yīng)的。  
（2） 在抗感染免疫中的應(yīng)用  
       CTL在抗病毒感染的免疫應(yīng)答中占有主要地位，而CD4+輔助性T細(xì)胞亞群Th1/Th2的平衡在抵御病毒感染中起著同樣重要的作用。在HIV研究方面，由MHC-1類分子加工的不同抗原經(jīng)CTL識別并產(chǎn)生免疫應(yīng)答在控制HIV-1感染中同樣起重要作用。利用ELISPOT方法檢測CK如IFN2γ就可以進(jìn)一步了解到針對HIV特異的CTL應(yīng)答及相關(guān)免疫信息。  
       此外，ELISPOT法還用于評價由HIV-1感染引起粘膜的CD4+T細(xì)胞免疫應(yīng)答以及HIVgp 120g與霍亂毒素共表達(dá)的DNA疫苗的免疫源性。在其他研究中，ELISPOT還用來檢測通過直腸免疫低劑量甲肝疫苗而產(chǎn)生的細(xì)胞免疫應(yīng)答。在急性的自限性肝炎中，以Th1為主的應(yīng)答促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，且在控制病毒感染及延緩慢性疾病的發(fā)展方面有重要作用。  
       在許多抗細(xì)菌免疫研究中，該方法也發(fā)揮了重要作用。例如：應(yīng)用ELISPOT試驗證實表達(dá)大腸桿菌MalE蛋白的重組卡介苗（rBCG.MalE）誘導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答是CD4+T細(xì)胞依賴的，rBCG.MalE 誘導(dǎo)的特異CD4+T細(xì)胞應(yīng)答存在Th1/Th2平衡轉(zhuǎn)換現(xiàn)象，并逐步形成Th1/ Th2 混合應(yīng)答。  
（3） 臨床方面  
       目前，已經(jīng)實現(xiàn)臨床檢驗的領(lǐng)域是對肺結(jié)核（TB）的檢測。而zui近的研究熱點就是對于移植的預(yù)測。受體對供體特異性HLA抗體一直以來都是器官移植的一大障礙，因為它們的存在不僅介導(dǎo)超急性排斥反應(yīng)而且還可導(dǎo)致急性排斥反應(yīng)。因此，HLA抗體的存在限制了異體抗原敏感患者對供體器官的需要，因而增加了等待移植的時間。在心臟，肝臟和腎臟異體移植后早期出現(xiàn)的并發(fā)癥如急性排斥反應(yīng)與移植前存在的異體免疫臨床相關(guān)性迫切需要一種恰當(dāng)?shù)臋z測方法在器官移植前能了解受體對供體特異性體液免疫的功能狀態(tài)。  
    在接受移植的人群中，部分因有多次輸血、或既往有異體移植失敗或多次妊娠史體內(nèi)曾經(jīng)存在陽性異體抗體，在他們接受異體移植時，現(xiàn)有的檢測方法只能顯示他們對異體的免疫功能正常。但他們體內(nèi)存在記憶B淋巴細(xì)胞，一旦受到相應(yīng)HLA 抗原的刺激則會喚起免疫反應(yīng)，這不僅影響著移植的結(jié)果，甚至?xí)霈F(xiàn)危及患者生命的、與移植相關(guān)的并發(fā)癥。  
    ELISPOT是一種強(qiáng)有效的檢測單個抗體分泌細(xì)胞的方法，具有很高的敏感性。因此，刺激記憶B淋巴細(xì)胞增殖、分化成漿細(xì)胞，并建立一種特異性ELISPOT方法檢測HLA抗體產(chǎn)生細(xì)胞是*手段。 如果ELISPOT要進(jìn)一步推廣應(yīng)用，特別是臨床應(yīng)用，其標(biāo)準(zhǔn)化將是一個十分重要的問題。美國FDA和NIH等已經(jīng)開始建立ELISPOT的標(biāo)準(zhǔn)化流程，相信隨著ELISPOT技術(shù)的成熟、標(biāo)準(zhǔn)化程序的建立，它的應(yīng)用將更加廣泛。  



ELISPOT 實驗方案  

對應(yīng)BD的試劑盒  
實驗材料的準(zhǔn)備  
試劑盒中沒有但是必須的  
材料:    
• 已消毒的移液器 （Gilson）。單道20ul,100ul,200ul,1ml, 8/12道200ul  
• 無菌一次性聚苯乙烯吸量管 （1ml, 5ml, 10ml）（Axygen）。  
• 一次性乳膠手套 。  
• 無菌一次性離心管（15ml、50ml）（Corning cat#430052 and 430290）。  
• 吸水紙（衛(wèi)生紙）  
• 無菌tip頭, 200ul,1ml,  

    試劑:  
1.        PBS 無菌 300ml/10板，有菌4000ml/10板 在準(zhǔn)備包被抗體時不要使用商業(yè)化的PBS  
2.        ddH2O（無菌） 對于10塊ELISPOT板，200 ml  
3.        有菌洗滌緩沖液（PBST）：有菌3000ml/10板  
Tween-20 進(jìn)口  
4.        有菌洗滌緩沖液（PBS）：有菌1000ml/10板  
5.        培養(yǎng)液：無血清培養(yǎng)基 （P/S, 2 mM 的谷氨酰胺，以及 Hepes buffer）。  
6.         PMA ＋ionomycin.  
    Phorbol 12-myristate 13-acetate （PMA; Sigma Chemical Co., product nr. P8139 is recommended）.  
PMA   
貯 存 液：PMA溶于DMSO，濃度為1mg/ml，-20℃保存  
工 作 液：貯存液 1:4000稀釋于無血清培養(yǎng)基中  
此時為 250ng/ml   
 Calcium ionophore （ionomycin; Sigma Chemical Co, product nr. I0634 is recommended）.  
Ionomycin   
貯 存 液：Ionomycin溶于DMSO，濃度為1mg/ml，-20℃保存  
工 作 液：貯存液 1:200稀釋于無血清培養(yǎng)基中  
此時為 5μg/ml   
50ml混合刺激劑＝PMA工作液12.5ul，Ionomycin工作液250ul，無血清培養(yǎng)基補(bǔ)齊  


7.        10% 熱滅活胎牛血清 （Hyclone cat# ALH14384 ）  
8.        抗原  
       
設(shè)備:  
• 洗板器: 自動或手動 （洗瓶, 手動分液器等）。  
•CO2-細(xì)胞培養(yǎng)箱 （37°C）。  
4°C冰箱  
無菌間無菌操作臺  



Preparation kit reagents    
1．包被用抗體  
取50 μl加到10ml PBS中。（足夠包被1塊96孔板，100 μl/well）。  
對10塊板子， 500ul加到100ml PBS中  
2．生物素標(biāo)記的檢測抗體（detector antibody）  
取50μl加到10 ml  Dilution buffer中。（混勻后加入ELISPOT板，100 μl/well）。  
對10塊板子， 500ul 加到100ml Dilution buffer（PBS+10%FBS）  
3．STREP-HRP  
取100μl加到10 ml  Dilution buffer中。（混勻后加入ELISPOT板，100 μl/孔）。  
對10塊板子， 1ml 加到100ml Dilution buffer  

4 顯色激活系統(tǒng)（Activation system）  
對于1塊ELISPOT板，200ul AEC Chromogen + 10 ml AEC Substrate，混勻，10分鐘內(nèi)用完。（100 μl/孔）。  

ELSPOT實驗步驟  
Day 1   
包被ELISPOT板 16：30  

1.        在ELISPOT板中每孔加入包被抗體100μl，4℃。  
Day 2  
ELISPOT板的封閉  17：00  

2.        取出已包被的ELISPOT板，吸棄每孔中的包被抗體溶液。  
3.        用*無血清培養(yǎng)基洗1次。  
4.        在ELISPOT板中，每孔加入200μl*無血清培養(yǎng)基。室溫2h。（8道排槍）  
5.           
PBMC加入ELISPOT培養(yǎng)板 20：00  

6.        取出封閉2h的ELISPOT板，吸棄每孔中的封閉液。（不要洗板！）  
7.        在ELISPOT板中，先加30μl 無血清培養(yǎng)基（12道排槍）和20μl肽庫（8道排槍），后加50μl細(xì)胞（8道排槍） （每孔活細(xì)胞總數(shù)為2×105，每個病人需活細(xì)胞總數(shù)為10×106，體積為2.5 ml。每條多肽的終濃度為5μg/ml，活細(xì)胞的工作濃度為4×106/ml，活細(xì)胞的終濃度為2×106/ml）。  
陽性孔中每孔加入50μl 細(xì)胞和30μl無血清培養(yǎng)基和20μl PMA+Inomysin（工作液濃度分別為250ng/ml和5ug/ml，終濃度分別為50ng/ml和1ug/ml）。  
8.        用low evaporation lid 蓋好ELISPOT板，放入37℃ CO2孵箱培養(yǎng)30 h。  
注意：不要晃動ELISPOT板。 

Day 4   
二抗和GABA標(biāo)記，顯色反應(yīng) 8：30  
9.        培養(yǎng)30h后，取出ELISPOT板，甩去細(xì)胞后。  
10.    用去離子水洗滌2次。每次浸泡5分鐘。  
11.    用0.05％PBST洗滌3次。每次浸泡2分鐘。  
12.    每孔加入100μl 生物素化的detector Ab（8道排槍）。室溫2小時。  
13.    取出ELISPOT板，倒去detector Ab溶液，用PBST洗滌3次。每次浸泡2分鐘  
每孔加入100μl Strep-HRP溶液（8道排槍）。室溫1小時  
14.    取出ELISPOT板，倒去Strep-HRP溶液。  
15.    PBST洗滌4次。每次浸泡2分鐘。  
16.    用PBS洗滌2次。每次浸泡2分鐘。  
17.    洗滌完畢后，在吸水紙上輕輕拍干ELISPOT板。  
每塊板子200ul AEC Chromogen + 10 ml AEC Substrate，混勻，15分鐘內(nèi)用完。  
18.    每孔加入100 µl 配好的substrate（8道排槍）。在暗處、室溫下孵育（5～60分鐘）。  
出現(xiàn)斑點后，用自來水沖洗，中止反應(yīng)。室溫下干燥，檢測。