細(xì)胞計數(shù)法是用來計數(shù)細(xì)胞懸液中細(xì)胞數(shù)量的一種方法。一般利用計數(shù)板(血球計數(shù)板)進(jìn)行。即可用于分離(散)細(xì)胞培養(yǎng)接種前計數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量,也可用于對培養(yǎng)物的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計數(shù)。不論計數(shù)的對象如何,均須制備分散的細(xì)胞懸液。
一、 細(xì)胞計數(shù)板的操作步驟
1、制備細(xì)胞懸液:對于懸液培養(yǎng)的細(xì)胞,可直接進(jìn)行下面的步驟2(計數(shù)與計算過程)。如果計數(shù)對象為貼壁生長的細(xì)胞,首先需將培養(yǎng)物按如下步驟制備成細(xì)胞懸液。
1)、終止培養(yǎng),將培養(yǎng)液吸出,用PBS洗培養(yǎng)物一次。
2)、給培養(yǎng)瓶內(nèi)加入1ml 0.25%胰蛋白酶溶液,于37℃消化3~5min 。期間不斷在鏡下觀察。當(dāng)細(xì)胞變圓接近脫壁時,棄消化液。
3)、加入一定量的培養(yǎng)液(如果這些培養(yǎng)細(xì)胞不再有用,可加PBS),用吸管吹打,使細(xì)胞脫壁而制成細(xì)胞懸液。
2、計數(shù)與計算過程
1)、在細(xì)胞計數(shù)板中央放置計數(shù)的蓋玻片。
2)、用玻璃虹吸管吸取細(xì)胞,讓虹吸管在蓋玻片上或下側(cè)的計數(shù)板凹蹧處流出懸液,至蓋玻片被液體充滿為止。
3)、置顯微鏡下計數(shù)四角大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。對于壓線的細(xì)胞只計數(shù)在上線和左線者,對于細(xì)胞團(tuán)按單個細(xì)胞計數(shù)。
4)、按下式計數(shù)細(xì)胞懸液的密度:細(xì)胞密度=(4個大格細(xì)胞總數(shù)/4)×104個/ml 。
二、細(xì)胞計數(shù)板的注意事項:
1)、務(wù)必使分散成單個細(xì)胞,取樣計數(shù)前,充分混勻細(xì)胞懸液。
2)、顯微鏡下計數(shù)時,遇到2個以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán),應(yīng)按單個細(xì)胞計算。如果細(xì)胞團(tuán)>10%,說明細(xì)胞分散不充分。
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