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血細(xì)胞計(jì)數(shù)器的計(jì)數(shù)原理及操作流程
細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中，細(xì)胞計(jì)數(shù)是一項(xiàng)基本功，對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)條件以及需要定量的實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)都非常關(guān)鍵。這里介紹使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)的經(jīng)典方法以及中間一些需要注意的細(xì)節(jié)。
制備細(xì)胞懸液：
對(duì)于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，我們需要首先使用胰酶消化的方法使細(xì)胞從培養(yǎng)皿表面脫落
根據(jù)需要加入合適體積的培養(yǎng)基，將細(xì)胞進(jìn)行中和及稀釋，以得到均質(zhì)的細(xì)胞懸液。要求盡可能將細(xì)胞吹打散開，不要?dú)埩羧魏渭?xì)胞團(tuán)
準(zhǔn)備血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：
使用70%乙醇將蓋玻片和血細(xì)胞計(jì)數(shù)器清潔干凈
將將蓋玻片潤(rùn)濕（使用水或呼一口氣，目的是使蓋玻片與血細(xì)胞計(jì)數(shù)器接觸更緊密，易于粘連），并覆蓋至血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上
臺(tái)盼蘭染色（可選）：
如果需要計(jì)算細(xì)胞的活力，則需要將細(xì)胞懸液和0.4%臺(tái)盼蘭等體積混合
室溫孵育3-5分鐘，使臺(tái)盼蘭*進(jìn)入死細(xì)胞，使死細(xì)胞著藍(lán)色
血細(xì)胞計(jì)數(shù)器加樣：
使用吸管將細(xì)胞懸液或細(xì)胞/臺(tái)盼蘭混合液滴加到血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)池的邊緣。此時(shí)液滴將在虹吸的作用下進(jìn)入蓋玻片下方的計(jì)數(shù)池
以同樣的方式在另一側(cè)的計(jì)數(shù)池中也加入細(xì)胞懸液
將計(jì)數(shù)板放置幾分鐘使細(xì)胞*擴(kuò)散，同時(shí)用吸水紙吸除多余的液體
細(xì)胞計(jì)數(shù)：
在100倍顯微鏡下，移動(dòng)計(jì)數(shù)板將視野對(duì)準(zhǔn)計(jì)數(shù)板的中央大方塊，該方塊四周有一圈3條平行線包圍，中間有密集的網(wǎng)格。中央方塊區(qū)差不多剛好可以填滿整個(gè)視野（右上圖中標(biāo)記的3號(hào)位置）
使用手持式計(jì)數(shù)器記錄計(jì)數(shù)池四個(gè)角以及中央方塊內(nèi)的細(xì)胞數(shù)（1-5號(hào)位置，經(jīng)典的current-protocol推薦每個(gè)方塊細(xì)胞數(shù)應(yīng)不大于20-50），并重復(fù)記錄另一側(cè)計(jì)數(shù)池中的細(xì)胞數(shù)，總計(jì)十個(gè)方塊。計(jì)數(shù)的方法是只計(jì)算上邊和左邊壓線的細(xì)胞，而右邊和下邊壓線的細(xì)胞不予計(jì)算（下圖，總體原則是“計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右”，判斷標(biāo)準(zhǔn)為是否接觸三條邊線的中間線）。如果有多個(gè)細(xì)胞沒有吹散成團(tuán)存在，此時(shí)只可記為一個(gè)細(xì)胞。如果團(tuán)塊很多，則可能需要重新吹打甚至消化直至絕大多數(shù)細(xì)胞為單個(gè)細(xì)胞，
計(jì)算細(xì)胞數(shù)：
由血細(xì)胞計(jì)數(shù)器的構(gòu)造可以看出，血細(xì)胞計(jì)數(shù)器每個(gè)大方塊可以容納的體積為：
1 mm2×0.1 mm = 0.1 mm3 = 10-4 cm3 = 10-4 ml
也即每個(gè)大方塊的體積為萬(wàn)分之一毫升，因此在計(jì)算每毫升液體中的細(xì)胞數(shù)時(shí)需要乘以104。
在常規(guī)沒有使用臺(tái)盼蘭染色時(shí)，可以以下面公式計(jì)算每毫升培養(yǎng)基中細(xì)胞的個(gè)數(shù)：
每毫升培養(yǎng)基中細(xì)胞的個(gè)數(shù) = 每個(gè)方塊內(nèi)細(xì)胞的平均數(shù) × 細(xì)胞稀釋比例 × 104
如何使用了臺(tái)盼蘭染色，還需要計(jì)算活細(xì)胞的比率：
活細(xì)胞比率 = 臺(tái)盼蘭拒染細(xì)胞數(shù) / 總細(xì)胞數(shù)
此時(shí)細(xì)胞數(shù)的計(jì)算公式為：
每毫升培養(yǎng)基中活細(xì)胞的個(gè)數(shù) = 每個(gè)方塊內(nèi)細(xì)胞的平均數(shù) × 活細(xì)胞比率 × 細(xì)胞稀釋比例 × 2 × 104
注：乘2是由于在臺(tái)盼蘭染色時(shí)，進(jìn)行了等體積混合，相當(dāng)于稀釋了一倍。
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