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羊水細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方式

來(lái)源:重慶市華雅干細(xì)胞技術(shù)有限公司   2014年09月22日 14:23  
一、羊水細(xì)胞培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)法
 
1、采樣:選擇妊娠13-14周婦女,在無(wú)菌條件下抽取羊水5ml,立即注入無(wú)菌離心管中。
2、收集:離心分離細(xì)胞,1000rpm10分鐘,去上清,留0.5ml,輕打混勻。
3、接種:將混勻的羊水細(xì)胞種置于50ml或100ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),平均10ml羊水細(xì)胞收集的細(xì)胞種置一瓶加5-10ml混合培養(yǎng)液。
4、培養(yǎng):酒精燈火先封口,靜置培養(yǎng)48小時(shí)后觀察細(xì)胞貼臂及生長(zhǎng)情況,5-10天后可見(jiàn)瓶底面有大量羊水細(xì)胞生長(zhǎng)。
5、終止培養(yǎng):當(dāng)有大量圓形發(fā)亮細(xì)胞出現(xiàn)時(shí),加秋水仙素0.02-0.04ug/ml,作用10-12小時(shí)。
6、細(xì)胞收集:將培養(yǎng)液倒入一干凈離心管中,加0.025%的胰蛋白酶0.5-1ml/瓶,輕輕搖動(dòng),使培養(yǎng)瓶底面*接觸消化酶,然后用彎頭吸管吹打,待細(xì)胞全部脫落后加前培養(yǎng)液終止胰蛋白酶消化。用吸管移細(xì)胞懸液于離心管中。1000-2000rpm10分鐘,棄上清,留細(xì)胞沉慮。若一次消化不*,可反復(fù)消化。
7、低滲及預(yù)固定:加預(yù)溫37℃KCL溶液10ml,37℃溫育30分鐘,加0.5-1ml新鮮配制的3∶1甲醇冰乙酸固定液預(yù)固定,用氣泡吹打細(xì)胞使其混勻。
8、固定:用新鮮配制的3∶2甲冰固定三次,每次30分鐘。固定液加入時(shí)沿管壁緩慢加入。
9、制片及干燥:用絨毛制片。
10、分帶處理。
 
二、羊水細(xì)胞培養(yǎng)基蓋玻片培養(yǎng)法
 
1、采樣:選擇妊娠13-14周婦女,在無(wú)菌條件下抽取羊水5ml,立即注入無(wú)菌離心管中。
2、收集:離心分離細(xì)胞,1000rpm10分鐘,去上清,留0.5ml,輕打混勻。
3、接種:30mm培養(yǎng)皿中放蓋玻片1張,每片滴混勻的細(xì)胞液1-2滴,置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30-60分鐘。
4、培養(yǎng):取出后從蓋玻片外加培養(yǎng)液2ml,靜置培養(yǎng)48小時(shí)后觀察細(xì)胞生殖狀況并定時(shí)換液,5-10天后,可見(jiàn)大量成纖維細(xì)胞或上皮樣細(xì)胞生長(zhǎng)。
5、終止培養(yǎng):當(dāng)有大量圓形發(fā)亮細(xì)胞出現(xiàn)時(shí),加秋水仙素0.02-0.04ug/ml,作用10-12小時(shí)。
6、低滲:倒掉培養(yǎng)液,加預(yù)溫37℃0.075MKCL溶液5ml,37℃溫育30分鐘,鏡下可見(jiàn)脹大的羊水細(xì)胞,加0.5-1ml 3∶1甲醇:冰醋酸固定液預(yù)固定。
7、固定:倒掉低滲液,加5ml固定液固定30分鐘以上,反復(fù)3次。
8、干燥:將附有細(xì)胞的蓋玻片斜放于培養(yǎng)皿中,置80℃烤箱處理2-3小時(shí)。
9、膠片:將附有細(xì)胞的蓋玻片用樹(shù)脂膠封固于玻片上,正面朝外,小心細(xì)胞破壞。
 

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