一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>
學(xué)習(xí)和掌握瓊脂糖電泳法鑒定DNA的原理和方法。
二、實(shí)驗(yàn)原理
瓊脂糖凝膠電泳是用于分離、鑒定和提純DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。瓊脂糖是從瓊脂中提取的一種多糖，具親水性，但不帶電荷，是一種很好的電泳支持物。DNA在堿性條件下（pH8.0的緩沖液）帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中通過(guò)凝膠介質(zhì)向正極移動(dòng)，不同DNA分子片段由于分子和構(gòu)型不同，在電場(chǎng)中的泳動(dòng)速率液不同。溴化乙錠（EB）可嵌入DNA分子堿基對(duì)間形成熒光絡(luò)合物，經(jīng)紫外線照射后，可分出不同的區(qū)帶，達(dá)到分離、鑒定分子量，篩選重組子的目的。
三、實(shí)驗(yàn)材料
實(shí)驗(yàn)14提取的DNA樣品，
四、器具及藥品
    電泳儀，電泳槽，紫外透射反射儀，恒溫水浴鍋，微波爐，微量進(jìn)樣器，三羥甲基氨基甲烷，鹽酸，醋酸鈉，EDTA，瓊脂糖，溴酚藍(lán)，溴化乙錠。
五、實(shí)驗(yàn)步驟
1、安裝電泳槽
將有機(jī)玻璃的電泳凝膠床洗凈，晾干，用膠帶將兩端的開(kāi)口封好，放在水平的工作臺(tái)上，插上樣品梳。
2、瓊脂糖凝膠的制備
稱(chēng)取瓊脂糖溶解在電泳緩沖液中，（按0.3-1.5%的瓊脂糖含量，1-25kb大小的DNA用1%的凝膠，20-100kb的DNA用0.5%的凝膠，200-2000bp的DNA用1.5%的凝膠）置微波爐或沸水浴中加熱至*溶化（不要加熱至沸騰），取出搖勻。
3、灌膠
   將冷卻到60℃的瓊脂糖溶液輕輕倒入電泳槽水平板上。
4、待瓊脂糖膠凝固后，在電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液，然后拔出梳子。
5、加樣
   將DNA樣品與加樣緩沖液按4：1混勻后，用微量移液器將混合液加到樣品槽中，每槽加10-20μl，記錄樣品的點(diǎn)樣次序和加樣量。
6、電泳
   安裝好電極導(dǎo)線，點(diǎn)樣孔一端接負(fù)極，另一端接正極，打開(kāi)電源，調(diào)電壓至3-5V/cm，電泳1-3hr，當(dāng)溴酚藍(lán)移到距凝膠前沿1-2cm時(shí)，停止電泳。
7、染色和觀察
   取出凝膠，放在含有溴化乙錠的染色液中染色30min，即可在254nm的紫外燈下觀察，有橙紅色熒光條帶的位置，即為DNA條帶，或在紫外燈下照相記錄電泳圖譜。溴化乙錠是致癌劑，操作時(shí)要小心，必須戴手套。
 
附：
⑴5×TBE（tris-硼酸及EDTA）緩沖液的配制(1000ml)：
Tris  54g，硼酸27.5g，0.5mol/LEDTA20ml，將pH調(diào)到8.0，定容至1000ml，4℃冰箱保存，用時(shí)稀釋10倍。
⑵加樣緩沖液的配制：
0.25%溴酚藍(lán)，40%（W/V）蔗糖水溶液，4℃冰箱保存。
⑶溴化乙錠的配制：
    稱(chēng)取0.1g溴化乙錠，溶于10ml水，配成終濃度為10mg/ml的母液，4℃冰箱保存。染色時(shí)，吸取12.5μl的母液，加入250ml的水中，使其終濃度為0.5μg/ml，混合均勻。
⑷100倍TE緩沖液的配制：
1mol/LTris-HCl（pH8.0），100mmol/LEDTA
稱(chēng)取Tris121.1g，EDTA-Na₂37.23g，先用800ml雙蒸水，加熱攪拌溶解后，再用鹽酸調(diào)pH至8.0（大約加入鹽酸20ml），然后定容至1000ml。
⑸100倍電泳緩沖液的配制：
4mol/LTris-HCl（pH8..0），2mol/L醋酸鈉，200mmol/LEDTA
稱(chēng)取Tris242.2g，無(wú)水乙酸鈉82.03g，EDTA-Na₂37.23g，先用400ml雙蒸水加熱攪拌溶解后，再用冰乙酸調(diào)pH至8.0（大約加入冰乙酸50ml），然后定容至500ml。用時(shí)稀釋100倍。