平時(shí)在實(shí)驗(yàn)室zui常聽(tīng)到的一句話(huà)就是「實(shí)驗(yàn)為什么會(huì)是這樣的呢」。然后仔細(xì)一查找原因，往往是由于操作上面的不認(rèn)真，或是一些小小的細(xì)節(jié)沒(méi)有注意到。

小編為大家整理了實(shí)驗(yàn)小技巧，希望對(duì)大家有幫助。

質(zhì)粒 DNA 提取

提取質(zhì)粒的時(shí)候，zui后一步的酒精揮發(fā)很關(guān)鍵，基本上是其后續(xù)的酶切反應(yīng)的決定性因素。所以這一步盡量揮發(fā)長(zhǎng)一點(diǎn)時(shí)間，是空調(diào)吹熱風(fēng)，或是 37℃ 溫箱放長(zhǎng)一點(diǎn)的時(shí)間，我試過(guò)室溫到次日，酶切很好。

將 Amp 濃度提高到 200 ug/ml，下班前接種，次日一早收獲菌體，OD 雖然不高，質(zhì)粒豐度卻不一般。菌體量少些，操作體積（管數(shù)）也?。ㄉ伲?。

手提質(zhì)粒，如果用氛氯仿和氯仿兩步抽提，注意一下手法，嚴(yán)格按照參考書(shū)上面的操作的話(huà)，提出的質(zhì)粒不比任何質(zhì)粒提取試劑盒差，我感覺(jué)好像還好一點(diǎn)，我就用過(guò)一次試劑盒，比較了之后不如我手提的好，以后再也沒(méi)用過(guò)了。

Western Blot

做 western blot 的時(shí)候，大家往往會(huì)摸索一抗、二抗的濃度，封閉時(shí)間，曝光時(shí)間等等，而每次變換其中的一個(gè)條件就需要重新跑膠、轉(zhuǎn)膜，甚至重新提蛋白，這樣會(huì)浪費(fèi)大量的時(shí)間。其實(shí)*沒(méi)有必要這樣。一次轉(zhuǎn)膜后，將 PVDF 膜晾干，裁減成小塊，保存起來(lái)，用的時(shí)候取出一塊，沒(méi)有任何影響。這對(duì)于摸索條件的戰(zhàn)友來(lái)說(shuō)，節(jié)約了大量的時(shí)間。

做 western blot 轉(zhuǎn)膜時(shí)，膠放在轉(zhuǎn)膜緩沖液中一段時(shí)間，待膠在含有甲醇的緩沖夜中縮小的差不多后裝好轉(zhuǎn)膜裝置，我的經(jīng)驗(yàn)是把膜印在膠上直接在膜上畫(huà)出預(yù)染 maker 條帶，方便的很。因?yàn)楹芏鄷r(shí)候跑電泳時(shí)膠上的預(yù)染 maker 很清楚，等轉(zhuǎn)膜后就不是分辨的很清楚了。要注意畫(huà)好預(yù)染 maker 后就不要使膠和膜發(fā)生對(duì)位移動(dòng)了，以防 maker 失去參照價(jià)值。

器具的清潔非常重要，開(kāi)始做前，為了安全，尤其是裝膠的厚薄玻璃板，可以先用中性洗滌劑和自來(lái)水反復(fù)沖洗，確保無(wú)洗滌殘液后用蒸餾水沖洗 2-3 遍，然后用去離子水沖洗一遍。zui后用 95％ 酒精再擦一遍后晾干備用。

配膠現(xiàn)用現(xiàn)配，先配下層膠（分離膠），后配上層膠（濃縮膠或積層膠），而且在臨灌膠前加 APS 并迅速混勻，即用移液槍抽吸與注入1-2 次即可。

緩沖液和培養(yǎng)基配置

將緩沖液配方中的成分分別以 10-100 倍配成母液儲(chǔ)存，需要的時(shí)候只需將相應(yīng)的母液混合，補(bǔ)加水稀釋即可；

配培養(yǎng)基時(shí)通常會(huì)忘記各成分的量，如配 LB 時(shí)的三個(gè)成分不記得到底哪個(gè)是 5 g，哪個(gè)要 10 個(gè)，因此可以在常用的試劑瓶的標(biāo)簽上注明所需的量，如配 LB 時(shí)，在 NaCl 瓶外注明 10 g/L， yeast 5 g/L， tryton 10 g/L 等，很方便，不需要每次配之前臨時(shí)翻書(shū)。

PCR

在做克隆鑒定的時(shí)候經(jīng)常需要在酶切鑒定前進(jìn)行 PCR 鑒定，每次配制 PCR 反應(yīng)液很繁瑣，可以將其配置類(lèi)似kit的形式，按你需要的反應(yīng)體系列表，然后放大 100 倍配制 100×主反應(yīng)液（100 次反應(yīng)），其中含 buffer，Mg2+，dNTPs，但不含引物和 Taq 酶，然后可以 10× 分裝或一管儲(chǔ)存在－20℃，在需要的時(shí)候拿出融開(kāi)，然后按所需的 PCR 反應(yīng)個(gè)數(shù)吸取相應(yīng)的倍數(shù)，再補(bǔ)加相應(yīng)反應(yīng)倍數(shù)的 Taq 和引物，混勻后分裝。

這樣做的好處如下：可極大的節(jié)省寶貴的時(shí)間，可早點(diǎn)收工，看球；避免每次反應(yīng)加樣不均的可能；大大減少 PCR 假陽(yáng)性的產(chǎn)生。

酶切

如果是要做酶切，提質(zhì)粒的zui后一步是用水溶解 DNA，因?yàn)?TE 里面的離子會(huì)影響酶切的效率。

雙酶切制備克隆插入片段的載體，選擇帶有外源片段的質(zhì)粒，是否酶切*，從電泳條帶的分子量上可以比較明確地判斷。空質(zhì)粒單切*和雙切*在分子量上差異不大。

在做酶切時(shí)，也可以象 PCR 一樣配制主反應(yīng)液，每次反應(yīng)前先列好反應(yīng)的體系，算好需要的反應(yīng)數(shù)，然后按所需反應(yīng)的體系按所需反應(yīng)數(shù)放大，加入 buffer、酶、水，質(zhì)粒欄空缺，然后混合后按質(zhì)粒 DNA 的體積分裝，然后再在每管中加入相應(yīng)體積的質(zhì)粒 DNA 酶切。

這樣做的好處如下，特別是當(dāng)同時(shí)有十幾個(gè)陽(yáng)性克隆需要鑒定時(shí)尤為明顯：各反應(yīng)成分均一；可大大減少限制型內(nèi)切酶的使用；節(jié)省時(shí)間。

大腸桿菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

有時(shí)候*天涂的轉(zhuǎn)化平板、次日早晨轉(zhuǎn)化子可能長(zhǎng)成的菌落比較大（1~2 mm 以上，BL21 就長(zhǎng)得快），下一步轉(zhuǎn)化子做質(zhì)粒鑒定。這個(gè)情況下可以直接挑取一塊菌苔（勿帶出培養(yǎng)基），50 ul 酚/氯仿懸浮菌體，放置兩分鐘，加 40 ul TE 抽提，上層 TE 吸出后再氯仿抽提一次，吸取上層 TE 即質(zhì)粒提取液。提取的質(zhì)?？梢灾苯佑糜陔娪竞兔盖?。這樣操作，可以省去轉(zhuǎn)接液體試管的培養(yǎng)步驟，至少節(jié)省 6~8 h的時(shí)間。但是，要在各步驟都控制得很好的情況下才能保證提取和酶切的效果，不同的實(shí)驗(yàn)室或者操作者未必能夠很方便地重復(fù)。

轉(zhuǎn)化時(shí)一定要做一個(gè)宿主菌的對(duì)照，即重組質(zhì)粒涂板后再用宿主菌涂相應(yīng)抗性的平板，以確定第二天長(zhǎng)出來(lái)的克隆是否正確，我當(dāng)時(shí)做了三次轉(zhuǎn)化之后才發(fā)現(xiàn)不成功竟然是由于 BL21 可以在 Amp（+）的平板上面生長(zhǎng)。

蛋白質(zhì)的表達(dá)、分離、純化

當(dāng)?shù)鞍状罅康谋磉_(dá)時(shí)，包含體的形成幾乎是不可避免的，而且很難通過(guò)改變一些誘導(dǎo)條件來(lái)改變，zui有效的辦法就是換表達(dá)系統(tǒng)，所以如果時(shí)間還充分的話(huà)，可以嘗試一下，如果時(shí)間較短了，還是安心的做包含體蛋白的處理，變性之后的蛋白通過(guò)一些方法復(fù)性率也可以達(dá)到 60％ 以上。

細(xì)胞凍存和復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)

可以提前把需要的體積的培養(yǎng)液放到培養(yǎng)瓶里，擰松瓶蓋，放到孵箱里半小時(shí)到 1 h，這樣溫度和 pH 值都已經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)了。

為防止凍存管在升溫時(shí)爆裂等，可以在放入水浴前就提前在超凈臺(tái)里把蓋子擰松一下然后再擰上。從液氮罐里拿出來(lái)不是說(shuō)一定要分秒必爭(zhēng)地放入水浴。細(xì)胞從液氮的零下100 多度升到比如 - 80℃ 這個(gè)過(guò)程對(duì)細(xì)胞沒(méi)有損害。有足夠的時(shí)間處理這些。只不過(guò)一旦細(xì)胞化了，就應(yīng)該爭(zhēng)分奪秒地把它放入培養(yǎng)液了，主要是為了稀釋 DMSO。常溫下高濃度 DMSO 對(duì)細(xì)胞的損害比較大。

水浴溫度 40℃ 應(yīng)該也沒(méi)問(wèn)題，但正規(guī)的 protocol 上從來(lái)都只說(shuō) 37℃。反正應(yīng)該相差不大，但不能太高了。另外，不必等細(xì)胞全化了再?gòu)乃±锶〕鰜?lái)。只要冰塊浮起來(lái)了就差不多了。我一般zui多水浴不超過(guò) 1.5 min。然后經(jīng)過(guò)噴酒精消毒什么的差不多又半分鐘過(guò)去了。每次都還有沒(méi)化的。先把已經(jīng)融解的部分吸到培養(yǎng)瓶里，再?gòu)呐囵B(yǎng)瓶里吸些培養(yǎng)液到凍存管里，余下的冰塊瞬間就化了，再一起吸到培養(yǎng)瓶里。