培養(yǎng)細胞傳代根據(jù)不同細胞采取不同的方法。貼壁生長的細胞用消化法傳代;部分貼壁生長的細胞用直接吹打可傳代;懸浮生長的細胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代,或用自然沉降法吸除上清后,再吹打傳代。
1.人無菌室之前用肥皂洗手,用75%酒精擦拭消毒雙手。
2.倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài),確定細胞是否需要傳代及細胞需要稀釋的倍數(shù)。將培養(yǎng)用液置37℃下預熱。
3.超凈臺臺面應(yīng)整潔,用0.1%新潔爾滅溶液擦凈。
4.打開超凈臺的紫外燈照射臺面20min左右,關(guān)閉超凈臺的紫外燈,打開抽風機清潔空氣,除去臭氧。
5.點燃酒精燈;取出無菌試管,巴士德吸管和刻度吸管;安上橡皮頭;過酒精燈火焰略燒后插在無菌試管內(nèi)。
6.將培養(yǎng)用液瓶口用75%酒精消毒,過酒精燈火焰后斜置于酒精燈旁的架子上。
7.倒掉培養(yǎng)細胞的舊培養(yǎng)基。酌情可用2—3mLHanks液洗去殘留的舊培養(yǎng)基,或用少量胰酶涮洗一下。
8.每個大培養(yǎng)瓶加入1mL胰酶,小瓶用量酌減,蓋好瓶蓋后在倒置顯微鏡下觀察,當細胞收回突起變圓時立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,使細胞脫離胰酶,然后將胰酶倒掉。注意勿使細胞提早脫落入消化液中。
9.加入少量的含血清的新鮮培養(yǎng)基,反復吹打消化好的細胞使其脫壁并分散,再根據(jù)分傳瓶數(shù)補加一定量的含血清的新鮮培養(yǎng)基(7~10mL/大瓶,3~5mL/小瓶)制成細胞懸液,然后分裝到新培養(yǎng)瓶中。蓋上瓶蓋,適度擰緊后再稍回轉(zhuǎn),以利于CO2氣體的進入,將培養(yǎng)瓶放回CO2培養(yǎng)箱。
10.對懸浮培養(yǎng)細胞,步驟7-9不做??蓪⒓毎麘乙哼M行離心去除舊培養(yǎng)基上清,加入新鮮培養(yǎng)基,然后分裝到各瓶中。
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