分光光度計已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器。常用于核酸、蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量。我們實驗室主要是用來測物質(zhì)的光度以求得物質(zhì)的濃度或者酶活。

基本原理

分子的紫外可見吸收光譜是由于分子 中的某些基團(tuán)吸收了紫外可見輻射光后，發(fā)生了電子能級躍遷而產(chǎn)生的吸收光譜。它是帶狀光譜，反映了分子中某些基團(tuán)的信息，可以用標(biāo)準(zhǔn)光譜圖再結(jié)合其它手段進(jìn)行定性分析。

朗伯-比爾定律：當(dāng)一束平行單色光通過含有吸光物質(zhì)的稀溶液時，溶液的吸光度與吸光物質(zhì)濃度、液層厚度乘積成正比，即

                              A= kcl

   式中比例常數(shù)k與吸光物質(zhì)的本性，入射光波長及溫度等因素有關(guān)。c為吸光物質(zhì)濃度，l為透光液層厚度。

組成

  各種型號的紫外－可見分光光度計，就其基本結(jié)構(gòu)來說，都是由五個基本部分組成，即光源、單色器、吸收池、檢測器及信號指示系統(tǒng)。

1.光源

在紫外可見分光光度計中，常用的光源有兩類：熱輻射光源和氣體放電光源。       

熱輻射光源用于可見光區(qū)，如鎢燈和鹵鎢燈；氣體放電光源用于紫外光區(qū)，如氫燈和氘燈。

2．單色器

單色器的主要組成：入射狹縫、出射狹縫、色散元件和準(zhǔn)直鏡等部分。

單色器質(zhì)量的優(yōu)劣，主要決定于色散元件的質(zhì)量。色散元件常用棱鏡和光柵。

3.吸收池

吸收池又稱比色皿或比色杯，按材料可分為玻璃吸收池和石英吸收池，前者不能用于紫外區(qū)。吸收池的種類很多，其光徑可在0.1~10cm之間，其中以1cm光徑吸收池zui為常用。

4、檢測器

檢測器的作用是檢測光信號，并將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘枴，F(xiàn)今使用的分光光度計大多采用光電管或光電倍增管作為檢測器。

5、信號顯示系統(tǒng)

常用的信號顯示裝置有直讀檢流計，電位調(diào)節(jié)指零裝置，以及自動記錄和數(shù)字顯示裝置等。

操作步驟

操作之前

1.1　開啟電源進(jìn)行初始化

開啟主機(jī)電源，分光光度計將按屏幕所顯示的項目進(jìn)行自檢和初始化，如下圖所示。所有項目檢測完畢，初始化結(jié)束，整個過程大約需要4min（若使用多池檢測需5min）。每個項目進(jìn)行初始化操作時將被加亮顯示，當(dāng)初始化完成后，該項右邊的星標(biāo)也將加亮顯示。但是，如果檢測到任何異常，初始化過程將立即中止，星標(biāo)也不會加亮顯示。

1.2　屏幕顯示和觸摸鍵盤

UV-1700的觸摸鍵盤圖可用數(shù)字鍵0~9和功能鍵F1~F4選擇不同屏幕中的模式和設(shè)置。選擇時，按下相應(yīng)的數(shù)字鍵或功能鍵即可，無需按ENTER鍵確認(rèn)。此外，輸入數(shù)值時，如波長設(shè)置或顯示模式等，必須按ENTER鍵確認(rèn)輸入值。

下面介紹每個鍵的基本功能，在不同屏幕下有一些鍵可能被賦予特殊的功能。

①   START/STOP鍵

　　一旦參數(shù)設(shè)置完成，可用該鍵開始和停止測量過程。

②   AUTO ZERO鍵

按該鍵，當(dāng)前波長的吸光度自動調(diào)整為0（100%T）。測量前，必須確保在樣品側(cè)和參比側(cè)中都放有盛有空白的比色池。

③   GOTOWL鍵

該鍵可用來改變當(dāng)前的波長。

④   ENTER鍵

輸入數(shù)值后，按該鍵確認(rèn)。

⑤   Cursor光標(biāo)鍵（＜（-），＞）

這組鍵可控制液晶顯示屏幕中光標(biāo)的左右移動。輸入數(shù)值時，左光標(biāo)鍵還可以用來輸入負(fù)值（-）。

⑥   Function功能鍵（F1~F4）

這組鍵的功能與液晶顯示屏幕下方所顯示的功能相對應(yīng)。

⑦   RETURN鍵

按下該鍵可返回當(dāng)前屏幕的前一屏。

⑧   MODE鍵

用該鍵可從每種測量模式的參數(shù)設(shè)置屏返回到主模式屏。

⑨   Print打印鍵

用該鍵可輸出當(dāng)前屏幕顯示的硬拷貝。

⑩   Numeric數(shù)字鍵

用該鍵可輸入數(shù)值。

?   CE鍵

用該鍵可清除數(shù)值輸入錯誤。按該鍵，已輸入的數(shù)值將被清除，可重新輸入正確的數(shù)值。

模式選擇和共享操作

初始化完成后即顯示模式選擇屏幕

各種模式概述：

在模式選擇屏幕下選擇各種測量模式，即顯示各自的參數(shù)配置屏幕。

①   光度模式

在固定波長下測量樣品的吸光度或%透光率。

②   光譜模式

掃描波長范圍以測量隨波長變化的樣品的吸光度和%透光率。也可進(jìn)行單光束能量測量。對測得光譜可進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，如峰檢出、平滑處理和數(shù)學(xué)計算等。

③   定量模式

用標(biāo)準(zhǔn)樣品建立校正曲線，并對未知樣品進(jìn)行定量測量。

測量方法有：1、波長法；2、波長法；3、波長法；4、微分定量法。另外，可用下列方法建立校正曲線：K-系數(shù)法、單點(diǎn)校正曲線法、多點(diǎn)校正曲線法。

④   動力學(xué)模式

由吸光度隨時間的變化計算酶的活性。

若使用多池支架（可選配），zui多可測量16個樣品。以下是可供選用的測量方法：

1、波長動力學(xué)測量；2、波長動力學(xué)測量；3、多池動力學(xué)測量；4、速率測量。

⑤   時間掃描模式

該功能用于測量固定波長下吸光度、透光率或能量隨時間的變化。使用多池支架（可選配）zui多可測量16個樣品，還可以對測得數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)學(xué)計算等數(shù)據(jù)處理。

⑥   多組分測量模式

可定量分析zui多8種組分的樣品。使用每種組分的純品作標(biāo)準(zhǔn)樣品，制作校正曲線，進(jìn)行定量測量。

⑦   光度測量（多波長）

zui多可8個任意波長，然后分別測量每個波長處的吸光度和透光率。測得吸光度后，可選擇三個計算式中的一個，對zui多為四個波長下的測得數(shù)據(jù)進(jìn)行計算，并輸出測量結(jié)果。

·2波長處測得值間的比值/差值和3波長測量值的計算

·用四數(shù)據(jù)計算式進(jìn)行計算：(K1A1+K2A2+K3A3+K4A4)×K5

·用四數(shù)據(jù)計算式進(jìn)行計算：K5×(K1A1+K2A2)/(K3A3+K4A4)

Kn：相關(guān)系數(shù)；An：吸光度。

⑧   可選配程序包

使用可選配程序包時選用此模式?？蛇x配DNA/蛋白質(zhì)程序包。

⑨   公用模式

在該模式下可設(shè)置和改變儀器的基本操作參數(shù)。

光度測量

操作步驟如下：

1、在模式選擇屏幕中選擇＜1. Photometric光度＞選項，將顯示參數(shù)配置屏幕。

2、用GOTOWL鍵設(shè)定測量波長。

3、按F2鍵設(shè)定進(jìn)樣控制。

3、按START/STOP鍵時，測量開始，顯示測量屏幕。

4、如需做空白校正，應(yīng)在測量前先設(shè)置空白樣品，然后按AUTOZERO鍵，將測量值置為0ABS（100%）。

注意事項

?    1、比色皿使用時注意不要沾污或?qū)⒈壬蟮耐腹饷婺p，應(yīng)手持比色皿的毛面。

?    2、待測液制備好后應(yīng)盡快測量，避免有色物質(zhì)分解，影響測量結(jié)果。

?    3、測得的吸光度A控制在0.2~0.8之間，超過1.0時要做適當(dāng)稀釋。

?    4、開關(guān)試樣室蓋時動作要輕緩。

?    5、不要在儀器上方傾倒測試樣品，以免樣品污染儀器表面，損壞儀器。

?    6、比色皿在盛裝樣品前，應(yīng)用所盛裝樣品沖洗兩次，測量結(jié)束后比色皿應(yīng)用蒸餾水清洗干凈后倒置晾干。若比色皿內(nèi)有顏色掛壁，可用無水乙醇浸泡清洗。

?    7、向比色皿中加樣時，若樣品流到比色皿外壁時，應(yīng)以濾紙點(diǎn)干，鏡頭紙擦凈后測量，切忌用濾紙擦拭，以免比色皿出現(xiàn)劃痕。

?    8、測定紫外波長時，需選用石英比色皿。

?    9、測量過程中不可打開測量室的窗門，否則會影響測量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

維護(hù)和保養(yǎng)

?    1、儀器使用一定周期后,內(nèi)部會積累一定量的塵埃,由維修工程師或在工程師指導(dǎo)下定期開啟儀器外罩對內(nèi)部進(jìn)行除塵工作,同時將各發(fā)熱元件的散熱器重新緊固,對光學(xué)盒的密封窗口進(jìn)行清潔,必要時對光路進(jìn)行校準(zhǔn),對機(jī)械部分進(jìn)行清潔和必要的潤滑,zui后,恢復(fù)原狀,再進(jìn)行一些必要的檢測、調(diào)校與記錄.

?    2、環(huán)境中的塵埃和腐蝕性氣體亦可以影響機(jī)械系統(tǒng)的靈活性、降低各種限位開關(guān)、按鍵、光電偶合器的可靠性,也是造成必須學(xué)部件鋁膜銹蝕的原因之一.因此必須定期清潔,保障環(huán)境和儀器室內(nèi)衛(wèi)生條件,防塵.

?    3、溫度和濕度是影響儀器性能的重要因素.他們可以引起機(jī)械部件的銹蝕,使金屬鏡面的光潔度下降,引起儀器機(jī)械部分的誤差或性能下降;造成光學(xué)部件如光柵、反射鏡、聚焦鏡等的鋁膜銹蝕,產(chǎn)生光能不足、雜散光、噪聲等,甚至儀器停止工作,從而影響儀器壽命.維護(hù)保養(yǎng)時應(yīng)定期加以校正.應(yīng)具備四季恒濕的儀器室,配置恒溫設(shè)備,特別是地處南方地區(qū)的實驗室.