關(guān)鍵詞:細(xì)胞傳代培養(yǎng)技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
實(shí)驗(yàn)材料和器材
材料:培養(yǎng)瓶，試管，移液管，巴斯德吸管，廢液缸，75%酒精棉球，酒精燈，培養(yǎng)細(xì)胞。
藥品:培養(yǎng)基(RPMI1640或DMEM)，小牛血清或胎牛血清，0.25%胰蛋白酶，Hank's液。
儀器:CO?培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，超凈臺(tái)。
實(shí)驗(yàn)步驟
1.人無菌室之前用肥皂洗手，用75%酒精擦拭消毒雙手。
2.倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，確定細(xì)胞是否需要傳代及細(xì)胞需要稀釋的倍數(shù)。將培養(yǎng)用液置37℃下預(yù)熱。
3.超凈臺(tái)臺(tái)面應(yīng)整潔，用0.1%新潔爾滅溶液擦凈。
4.打開超凈臺(tái)的紫外燈照射臺(tái)面20min左右，關(guān)閉超凈臺(tái)的紫外燈，打開抽風(fēng)機(jī)清潔空氣，除去臭氧。
5.點(diǎn)燃酒精燈;取出無菌試管，巴斯德吸管和刻度吸管;安上橡皮頭;過酒精燈火焰略燒后插在無菌試管內(nèi)。
6.將培養(yǎng)用液瓶口用75%酒精消毒，過酒精燈火焰后斜置于酒精燈旁的架子上。
7.倒掉培養(yǎng)細(xì)胞的舊培養(yǎng)基。酌情可用2-3mLHanks液洗去殘留的舊培養(yǎng)基，或用少量胰酶涮洗一下。
8.每個(gè)大培養(yǎng)瓶加入1mL胰酶，小瓶用量酌減，蓋好瓶蓋后在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞收回突起變圓時(shí)立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫離胰酶，然后將胰酶倒掉。注意勿使細(xì)胞提早脫落入消化液中。
9.加入少量的含血清的新鮮培養(yǎng)基，反復(fù)吹打消化好的細(xì)胞使其脫壁并分散，再根據(jù)分傳瓶數(shù)補(bǔ)加一定量的含血清的新鮮培養(yǎng)基(7~10mL/大瓶，3~5mL/小瓶)制成細(xì)胞懸液，然后分裝到新培養(yǎng)瓶中。蓋上瓶蓋，適度擰緊后再稍回轉(zhuǎn)，以利于CO?氣體的進(jìn)入，將培養(yǎng)瓶放回CO?培養(yǎng)箱。
10.對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，步驟7-9不做?？蓪⒓?xì)胞懸液進(jìn)行離心去除舊培養(yǎng)基上清，加入新鮮培養(yǎng)基，然后分裝到各瓶中。
【注意事項(xiàng)】
1.傳代培養(yǎng)時(shí)要注意無菌操作并防止細(xì)胞之間的交叉污染。所有操作要盡量靠近酒精燈火焰。每次只進(jìn)行一種細(xì)胞的操作。每一種細(xì)胞使用一套器材。培養(yǎng)用液應(yīng)嚴(yán)格分開。
2.每天觀察細(xì)胞形態(tài)，掌握好細(xì)胞是否健康的標(biāo)準(zhǔn):健康細(xì)胞的形態(tài)飽滿，折光性好，生長(zhǎng)致密時(shí)即可傳代。
3.如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有污染跡象，應(yīng)立即采取措施，一般應(yīng)棄置污染的細(xì)胞，如果必須挽救，可加含有抗生素的BSS或培養(yǎng)基反復(fù)清洗，隨后培養(yǎng)基中加入較大量的抗菌素，并經(jīng)常更換培養(yǎng)基等.