關鍵詞:原核表達服務|實驗技術服務
簡介：世界*品牌原核表達服務|實驗技術服務原裝，質量保證,*。
原核表達服務|實驗技術服務——pCzn1質粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
我們具備豐富的蛋白表達設計經(jīng)驗及實驗操作技巧，承諾客戶不成功不收費。我們所有的實驗數(shù)據(jù)真實可信，我們提供原始的表達菌株和克隆質粒，客戶可以依據(jù)我們的實驗報告重復我們的實驗結果。
產(chǎn)品品牌：   http://www.。。ｃｏｍ/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html    
測序實驗流程：
原核表達載體通常為質粒，典型的表達載體應具有以下幾種元件：
（1）選擇標志的編碼序列；
（2）可控轉錄的啟動子；
（3）轉錄調控序列(轉錄終止子，核糖體結合位點)；
（4）一個多限制酶切位點接頭；
（5）宿主體內自主復制的序列。
原核表達一般程序如下：
獲得目的基因－準備表達載體－將目的基因插入表達載體中（測序驗證）－轉化表達宿主菌－誘導靶蛋白的表達－表達蛋白的分析－擴增、純化、進一步檢測
一、試劑準備
1、LB培養(yǎng)基。
2、100mM IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中，0.22μm濾膜抽濾，-20℃保存。
二、操作步驟
（一）獲得目的基因
1、通過PCR方法：以含目的基因的克隆質粒為模板，按基因序列設計一對引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點），PCR循環(huán)獲得所需基因片段。
2、通過RT-PCR方法：用TRIzol法從細胞或組織中提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉錄形成cDNA*鏈，以逆轉錄產(chǎn)物為模板進行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。
（二）構建重組表達載體
1、載體酶切：將表達質粒用限制性內切酶（同引物的酶切位點）進行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。
2、PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載體。
（三）獲得含重組表達質粒的表達菌種
1、將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α，根據(jù)重組載體的標志（抗Amp或藍白斑）作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質粒，雙酶切初步鑒定。
2、測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確，進入下步操作。否則應篩選更多克隆，重復亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。
3、以此重組質粒DNA轉化表達宿主菌的感受態(tài)細胞。
（四）誘導表
1、挑取含重組質粒的菌體單斑至2ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃培養(yǎng)。
2、按1∶50比例稀釋菌，一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600 ≌0.4-1.0（0.6，大約需3hr）。
3、取部分液體作為未誘導的對照組，余下的加入IPTG誘導劑至終濃度0.4mM作為實驗組，兩組繼續(xù)37℃震蕩培養(yǎng)3hr。
4、分別取菌體1ml，離心12000g×30s收獲沉淀，用100μl 1%SDS重懸，混勻，70℃10min。
5、離心12000g×1min，取上清作為樣品，可做SDS-PAGE等分析。
三、注意事項
1、選擇表達載體時，要根據(jù)所表達蛋白的zui終應用考慮。如為方便純化，可選擇融合表達；如為獲得天然蛋白，可選擇非融合表達。
2、融合表達時在選擇外源DNA同載體分子連接反應時，對轉錄和轉譯過程中密碼結構的閱讀不能發(fā)生干擾。