超氧化物歧化酶（SOD）的活性測(cè)定 黃嘌呤氧化酶法

原 理:通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生 超氧陰離子自由基（O2-），后者氧化羥胺形成亞 硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈紫紅色，用可見光 分光光度計(jì)測(cè)其吸光度。當(dāng)被測(cè)樣品中含SOD時(shí)， 則對(duì)超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用，使 形成的亞硝酸鹽減少，比色時(shí)測(cè)定管的吸光度值 低于對(duì)照管的吸光度值，通過公式計(jì)算可求出被 測(cè)樣品中的SOD活力。 實(shí)驗(yàn)試劑： 硫酸鹽緩沖液，鹽酸羥胺，黃嘌呤，黃嘌 呤氧化酶，醋酸等。

實(shí) 驗(yàn)步驟： 計(jì)算方法： 每毫升反應(yīng)液中SOD 抑止率達(dá)50％時(shí)對(duì)應(yīng) 的SOD 量為一個(gè)SOD 活力單位（U），待測(cè) 樣品中的SOD 活力由下式計(jì)算： SOD抑制率（％）＝（A2-A1）/A2×100% SOD 活力（U/ml）＝（A2-A1） /A2×100%÷50％×反應(yīng)體系的稀釋倍數(shù)× 樣本測(cè)試前的稀釋倍數(shù) 式中：A1:測(cè)定管的吸光值；A2:空白管的 吸光值。

鄰苯三酚 自氧化法  原理： 在堿性條件下, 鄰苯三酚迅速氧 化釋放出超氧化物陰離子，生成有色中間 產(chǎn)物，吸光度隨之增加，使吸光度值與反 應(yīng)時(shí)間呈良好的線性關(guān)系。 SOD 加入鄰苯 三酚自氧化反應(yīng)體系后，催化超氧化物陰 離子生成過氧化氫，使有色中間產(chǎn)物的生 成受阻，導(dǎo)致吸光值下降，鄰苯三酚自氧 化速率降低，可作為測(cè)定 SOD 活性的理論 依據(jù)。

1.試劑： 0.1mol/L Tris-HCl 緩沖液 (pH8.2 2mmol/L EDTA) 0.2mol/L （Tris）三羥甲基氨基甲烷(內(nèi)含 4mmol/L 乙二胺四乙酸EDTA )100ml 與 0.2mol/L HCl44.76ml 混合加雙蒸水至 200ml pH8.2±0.01;鄰苯三酚(45mmol/L)以 10mmol/LHCl 配制成 6mmol/L溶液存放于冰 箱備用。

2.儀器: 紫外分光光度計(jì)，酸度計(jì)，恒溫 水浴鍋

實(shí) 驗(yàn)步驟： （1）.鄰苯三酚自氧化速率測(cè)定： 在試管中加入4.5ml 50mmol/LTris緩沖溶液，于 25℃保溫20min,加入10～20ul 30mmol/L鄰苯三 酚，立即計(jì)時(shí)并搖勻，傾于比色杯內(nèi)，于325nm 下，每隔1min測(cè)吸光值一次，空白以10mmol/L HCl代替鄰苯三酚，要求自氧化速率控制在0.070 OD/min左右。 ? . SOD活性測(cè)定： 將樣液加入到Tris緩沖溶液中，其余步驟同自 氧化速率測(cè)定方法。 活力單位定義：將一定條 件下使每毫升反應(yīng)液自氧化速率抑制50%的酶量 定義為一個(gè)單位（u）。