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SP法雙重染色步驟

來源:上海一研生物科技有限公司   2015年07月01日 11:49  

SP法雙重染色步驟
1~6步驟與SABC法相同,但無需使用生物素阻斷劑:
7.切片加入A特異性抗體(如兔抗A抗體),4=C孵育后,PBS沖洗3次,每次5分鐘
8.滴加生物素化二抗(如抗兔二抗),室溫孵育切片10分鐘,繼而PBS沖洗3次,每次5分鐘;
9.滴加鏈霉菌抗生物素蛋白—堿性磷酸酶,室溫孵育10分鐘,PBS沖洗3次,每次5分鐘
10.堿性磷酸酶顯色液(BCIP/NBT)顯色(紫藍色).PBS沖洗3次,每次5分鐘;
11.滴加0.05%鹽酸,室溫10分鐘(可避免已顯色的抗原褪色);
12.滴加抗小鼠二抗同種屬的非免疫血清,37~C孵育10分鐘;
13.滴加B特異性抗體(如小鼠抗B抗體),4~C孵育。PBS沖洗3次,每次5分鐘;
14.滴加生物素化抗小鼠二抗,室溫孵育切片10分鐘。PBS沖洗3次,每次5分鐘:
15.滴加鏈霉菌抗生物素蛋白—過氧化物酶,室溫孵育10分鐘,PBS沖洗3次,每次5分鐘
16.過氧化物酶顯色液(AEC)顯色(鮮紅色).PBS沖洗3次,每次5分鐘
17.蘇木精復染細胞核;
18.水溶性封片劑封片。

在使用SP法雙重染色之前需要對待測抗原的性質(zhì)、二抗的種屬類型和顯色系統(tǒng)進行詳細設(shè)計。購買免疫組化雙染試劑盒時;應(yīng)選擇與設(shè)計方案相同的配套試劑。在選擇一抗時應(yīng)避免定位在細胞的同一部位(如胞核、胞漿和胞膜)的兩種抗原,如果不可避免,選擇免疫熒光組織細胞化學雙重染色方法,因為兩種不同顏色的熒光重疊后呈現(xiàn)另一種顏色的熒光(如紅色熒光與綠色熒光重疊呈現(xiàn)黃色熒光),它比SP法的顯色系統(tǒng)更容易區(qū)別和辨認陽性結(jié)果。

在進行雙重染色之前,必須對所選擇的一抗分別進行單獨染色預實驗,預實驗條件必須與雙染條件相同,在觀察預實驗結(jié)果和抗體定位正確后,再進行雙染實驗。

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