實(shí)驗(yàn)步驟

純化的RNA的點(diǎn)雜交和狹線雜交：

1. 安裝印跡裝置

   1) 切一張合適大小的帶正電荷尼龍膜。用鉛筆標(biāo)上表示方向的記號(hào)。用水把膜簡(jiǎn)單弄濕，在20×SSC中室溫泡1 h。

   2) 在膜浸泡期間，先用0.1 mol/L NaOH小心清洗印跡裝置，再用無菌水洗干凈。

   3) 把兩片厚濾紙用20×SSC浸濕，再放到真空器頂部。

   4) 把樣品槽插入裝置的上部，把濕尼龍膜放在樣品槽加樣孔的底部，用吸管在膜的表面滾動(dòng)以去除膜與裝置夾層中的氣泡。

   5) 加緊夾板，連接真空管。

   6) 加入10×SSC直至液面沒過尼龍膜，關(guān)掉真空，再用10×SSC充滿。

2. RNA樣品準(zhǔn)備

   1) 把每個(gè)RNA樣品（溶解在10μl水）分別與30μl RNA變性液混合。

   2) 65℃溫育5 min，然后在冰上冷卻。

   3) 向每個(gè)樣品中加入等體積20×SSC。

   4) 輕輕向印跡裝置中吸入10×SSC，直到淹沒尼龍膜。

3. RNA樣品的印跡和RNA在膜上的固定

   1) 把所有樣品輕輕加入狹線中，然后輕輕吸干膜。當(dāng)所有樣品都鋪到膜上后，每個(gè)狹線用1 ml 10×SSC洗兩次。

   2) 當(dāng)?shù)诙蜗茨ね瓿珊?，繼續(xù)輕輕吸干膜。

   3) 取下膜，用紫外交聯(lián)、烘烤或微波照射把RNA固定在膜上。

4. 固定化RNA的雜交與洗膜

   1) 把膜放入烤盤或雜交爐中，加入10~20 ml預(yù)雜交液68℃溫育2 h。

   2) 把已變性的放射性標(biāo)記的探針直接加到預(yù)雜交液中。在適當(dāng)?shù)臏囟认吕^續(xù)溫育12～16 h。

   3) 雜交完后從塑料袋中取出膜，然后盡可能快地把膜轉(zhuǎn)移到室溫下裝有100～200 ml、1×SSC（0.1% SDS）的塑料容器中。蓋緊塑料容器，放到搖床上輕搖10 min。

   4) 把膜轉(zhuǎn)移到另一個(gè)裝有100～200 ml、預(yù)熱到68℃的0.5×SSC（含0.1% SDS）的塑料袋中，然后在此溫度下輕搖10 min。

   5)重復(fù)洗膜兩次，使總的洗膜次數(shù)達(dá)到三次。

   6) 用濾紙吸干膜，在-70℃條件下放射自顯影24～48 h（Kodak XAR-5 或相當(dāng)?shù)哪z片）。鎢酸鹽型的增感屏比舊式稀土型的效果更好。當(dāng)然，磷光成像儀也可以用來成像。

RNA斑點(diǎn)印跡的制備：

1．裁一張大小合適的濾膜，用軟鉛筆標(biāo)記RNA加樣的位置，一個(gè)cm的方格即可。

2．以20×SSC浸泡濾膜。

3．在65℃用以下溶液溫育5min，使10～20μg的總RNA變性。

置冰浴快速冷卻5min，用微量離心管離心片刻以回收液滴，將管置于冰浴。

4．將濾膜鋪在一疊經(jīng)20×SSC浸泡過的濾紙（如Whatman 3MM）上。

5．在膜上點(diǎn)樣，每孔4μl RNA，待一孔干燥后再加另一孔。

6．將濾膜置濾紙（3MM）上稍微晾干，用20×SSC漂洗片刻。

7．當(dāng)濾膜仍潮濕時(shí)，將濾膜RNA面朝下在紫外線透照儀照射3～5min，使RNA固定于濾膜上，此濾膜已可用于雜交。