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細(xì)胞遷移以及侵襲實(shí)驗(yàn)

來(lái)源:北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司   2015年07月31日 10:49  

  遷移實(shí)驗(yàn)(cell migration assay)

 實(shí)驗(yàn)材料
(1)ThinCert插入式細(xì)胞培養(yǎng)器: 24-well, 8.0-μm pore membranes (Greiner662638)

(2)細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑:無(wú)血清培養(yǎng)基,10%血清培養(yǎng)基,PBS,0.02%EDTA

(3)固定液:甲醇

(4)染色液:Giemsa染液

(5)封片劑:中性樹(shù)膠

(6)其他:小鑷子,棉棒,載玻片,蓋玻片

 操作步驟

(1)所有細(xì)胞培養(yǎng)試劑和ThinCert放在37℃溫育;

(2)待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,消化細(xì)胞,用PBS和無(wú)血清培養(yǎng)基先后洗滌一次,

 用無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞,計(jì)數(shù),調(diào)整濃度  為2×105 /ml;

(3)在下室(即24孔板底部)加入600-800μl 含10%血清的培養(yǎng)基,上 室加入100-

 150μl細(xì)胞懸液,繼續(xù)在孵箱培養(yǎng)24小時(shí);

(4)用鑷子小心取出ThinCert,吸干上室液體,移到預(yù)先加入約800μl甲醇的孔中,室溫固定30分鐘;

(5)取出ThinCert,吸干上室固定液,移到預(yù)先加入約800μl Giemsa染液 的孔中,室溫染色15-30分鐘;

(6)輕輕用清水沖洗浸泡數(shù)次,取出ThinCert,吸去上室液體,用濕棉棒小 心擦去上室底部膜表面上的細(xì)胞;

(7)用小鑷子小心揭下膜,底面朝上晾干,移至載玻片上用中性樹(shù)膠封片;

 (8)顯微鏡下取9個(gè)隨機(jī)視野計(jì)數(shù),統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

  注意事項(xiàng)

(1)根據(jù)待測(cè)細(xì)胞體積大小選擇合適孔徑的ThinCert。常用的為8.0-μm孔徑(如

  AGS細(xì)胞),如果細(xì)胞體積較大可以考慮用10-μm孔徑;

(2)根據(jù)待測(cè)細(xì)胞的遷移能力強(qiáng)弱調(diào)整細(xì)胞數(shù)和遷移時(shí)間。常規(guī)24-well  ThinCert接種細(xì)胞數(shù)約

 為2≈5×104/well, 遷移時(shí) 間 12≈36小時(shí);

(3)由于Greiner公司的24-Transwell內(nèi)含24個(gè)獨(dú)立的ThinCert,為了避免操作污染,

 每次實(shí)驗(yàn)可預(yù)先另準(zhǔn)備一塊24孔普通培養(yǎng)板(Greiner);

(4)如果細(xì)胞遷移能力較弱,下室液體可用3T3細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)24小時(shí)獲得 的上清加50μg/ml FN(Fibronectin),

 具體可查  閱相關(guān)文獻(xiàn);

(5)細(xì)胞懸液加入膜中央,盡量保證液面水平;

(6)固定染色擦洗時(shí)動(dòng)作小心,避免擦去膜底面的細(xì)胞。但一定要充分擦凈膜 表面上未遷移的細(xì)胞,

 以免影響讀數(shù)。尤其是  膜周邊上可用細(xì)牙簽或小鑷子纏上濕棉花擦洗,但要小心避免將膜戳破;

(7)Chamber和膜上都無(wú)法標(biāo)記,操作時(shí)應(yīng)小心避免混淆實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組;

(8)充分晾干,避免殘留水分導(dǎo)致鏡下聚焦不一致。



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