血小板衍生生長因子(PDGF)的檢測(cè):
血小板衍生生長因子(plaetderivedgrowthfactor,PDGF)能刺激成纖維細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的分裂增殖,以及誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞趨化。人皮膚成纖維細(xì)胞AGl523可作為檢測(cè)PDGF誘導(dǎo)細(xì)胞株增殖活性的靶細(xì)胞。
1.用含10%FCS的MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)AGl523細(xì)胞,于檢測(cè)前用0.25%胰蛋白酶消化生長的細(xì)胞。每個(gè)35mm培養(yǎng)皿中加入3X104細(xì)胞/2mL,置37~C,5%C02條件下培養(yǎng)養(yǎng)2d,洗去培養(yǎng)液。
2.加入系列稀釋的待測(cè)樣品、0.1mg/mL人血清白蛋白、0.02uCi(740Bq)3H-TdR和無血清的MCDBl05培養(yǎng)液,總體積為lmL,繼續(xù)培養(yǎng)48h。
3.吸去上清液,用3~4mL 5%三氯醋酸(TCA)溶液固定細(xì)胞10min,吸去TCA并洗滌,室溫自然干燥。
4.加入0.5mL含1%SDS的0.3mol/LNaOH溶解細(xì)胞15min,將溶解物轉(zhuǎn)移到液體閃爍管中,加5mL閃爍液,通過p-計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)cpm。約3ng/mL(0.1mmol/L)PDGF可誘導(dǎo)50%zui大3H-TdR的攝人。
BALB/c 3T3細(xì)胞可作為檢測(cè)PDGF促增殖作用的靶細(xì)胞,在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行。可采用’H-TdR摻入法或MTF法等測(cè)定增殖細(xì)胞數(shù)。但其他細(xì)胞因子對(duì)3T3細(xì)胞也有促增殖作用,可用相應(yīng)的中和抗體作阻斷試驗(yàn)。 血小板衍生生長因子(Plaet derived growth factor,PDGF)是貯存于血小板α顆粒中的一種堿性蛋白質(zhì)。是低分子量促細(xì)胞分裂素。能刺激停滯于G0/G1期的成纖維細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞進(jìn)入分裂增殖周期。血小板衍生生長因子PDGF于1974年發(fā)現(xiàn)的一種刺激結(jié)締組織等組織細(xì)胞增長的肽類調(diào)節(jié)因子,因其來源于血小板而得名,正常生理狀態(tài)下存在于血小板的α顆粒內(nèi),當(dāng)血液凝固時(shí)由崩解的血小板釋放出來并且被激活,具有刺激特定細(xì)胞趨化與促進(jìn)特定細(xì)胞生長的生物活性。此外,在組織受到損傷時(shí)巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞等也可以合成并釋放PDGF。肝臟受損時(shí),巨噬細(xì)胞、血小板、浸潤的炎細(xì)胞、受損的內(nèi)皮細(xì)胞及激活的肝星形細(xì)胞均可以分泌PDGF。以自分泌、旁分泌的方式發(fā)揮作用。結(jié)合的PDGF是分子量為30KD的熱穩(wěn)定糖蛋白,是靠二硫鍵相連的A、B兩條多肽鏈組合成的二聚體
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