一、標本制作

可制作涂片、印片、細胞單層培養(yǎng)物、組織切片，經適當固定或不固定，作免疫熒光染色用。

二、熒光抗體染色方法

（一）直接法

1．染色 切片經固定后，滴加經稀釋至染色效價如1：8或1：16的熒光抗體（如兔抗人γ-球蛋白熒光抗體或兔抗人IgG或IgA熒光抗體等），在室溫或37℃染色30min，切片置入能保持潮濕的染色盒內，防止干燥。
2．洗片 　傾去存留的熒光抗體，將切片浸入pH7.4或pH7.2PBS中洗兩次，攪拌，每次5min，再用蒸餾水洗1min，除去鹽結晶。
3．用50%緩沖（0.5mol/L碳酸鹽緩沖液pH9.0～9.5）甘油封固、鏡檢
4．對照染色

①正常免熒光血清染色，如上法處理切片，結果應為陰性。②染色抑制試驗（一步法）：將熒光抗體和未標記的抗體球蛋白或血清（相同）等量混合，如上法處理切片。結果應為陰性。為證明此種染色抑制不是由于熒光抗體被稀釋所致，可用鹽水代替未標記抗血清，染色結果應為陽性。此法結果較二步法穩(wěn)定。③類屬抗原染色試驗，前面已作敘述。

直接法比較簡單，適合做細菌、螺旋體、原蟲、真菌及濃度較高的蛋白質抗原如腎、皮膚的檢查和研究。此法每種熒光抗體只能檢查一種相應的抗原，特異性高而敏感性較低。

（二）間接法

（1）切片固定后用毛細滴管吸取經適當稀釋的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的濕度，37℃作用30min。然后用0.01mol/l pH7.2PBS洗兩次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液體。

（2）再滴加間接熒光抗體（如兔抗人γ-球蛋白熒光抗體等），同上步驟，染色30min，37℃，緩沖鹽水洗兩次10min，攪拌，緩沖甘油封固，鏡檢。

對照染色：①抗體對照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法進行染色，結果應為陰性。②抗原對照：即類屬抗原染色，亦應為陰性。③陽性對照。

間接法中上述方法稱雙層法（Double Layer Method）。另一種稱夾心法，即用未標記的特異性抗原加在切片上先與組織中之相應抗體結合，再用該抗原之熒光抗體重疊結合其上，而間接地顯示出組織和細胞中抗體的存在，方法步驟如下：